Tf-PEG-PEI載干擾質(zhì)粒靶向沉默NS對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移癌作用的研究.pdf

1、目的：通過(guò)建立裸鼠前列腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤模型及靜脈應(yīng)用Tf-PEG-PEI負(fù)載的NS靶向干擾質(zhì)粒，觀察NS沉默后對(duì)移植瘤的影響，探討PSMAe/p驅(qū)動(dòng)shRNA靶向干擾NS基因的效果及特異性，進(jìn)一步評(píng)價(jià)在全身給藥途徑下非病毒載體Tf-PEG-PEI在動(dòng)物體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移能力及其安全性。
　　方法：(1)將非病毒載體聚乙烯亞胺(PEI)修飾為Tf-PEG-PEI；對(duì)已構(gòu)建成功的pPSMAe/p-UPRT、PSMAe/p-shNS-poly(

2、A)兩種質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化細(xì)菌，擴(kuò)增、提取并純化質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序鑒定，以確保序列完全正確。(2)培養(yǎng)表達(dá)PSMA的LNCap細(xì)胞構(gòu)建裸鼠前列腺癌骨轉(zhuǎn)移模型，將裸鼠分為5組，每組4只，分別根據(jù)不同組別尾靜脈注射不同的質(zhì)粒及載體復(fù)合物，每5天注射1次，共注射5次，第一組：250μgTf-PEG-PEI和50μgPSMAe/p-NS-silencer，第二組：250ggTf-PEG-PEI和50μgpPSMAe/p-UPRT，第三組：250μ

3、gPEI和50μgPSMAe/p-NS-silencer，第四組：250μgTf-PEG-PEI，第五組：50μgPSMAe/p-NS-silencer。(3)治療過(guò)程中觀測(cè)腫瘤體積變化。處死裸鼠后取瘤，采用免疫組織化學(xué)染色和Westernblot檢測(cè)NS基因的蛋白表達(dá)。(4)獲取裸鼠心、肝、脾、肺、腎組織行HE染色，觀察有無(wú)中毒情況。
　　結(jié)果：(1)成功合成非病毒載體Tf-PEG-PEI，經(jīng)核磁共振氫譜鑒定連接成功。轉(zhuǎn)化細(xì)菌，

4、擴(kuò)增、提取并純化足量的兩種質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定質(zhì)粒正確。(2)成功構(gòu)建LNCap細(xì)胞裸鼠前列腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤模型，根據(jù)不同組別尾靜脈注射不同的質(zhì)粒及載體復(fù)合物后，通過(guò)計(jì)算腫瘤體積和繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)第一組與其余四組相比，在治療過(guò)程中腫瘤體積明顯減小，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余四組相比，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。移植瘤通過(guò)NS免疫組化染色和Westernblot檢測(cè)NS基因的蛋白表達(dá)，第一組與其余四組相比，NS染

5、色陽(yáng)性率明顯下降(P<0.05)，Westernblot檢測(cè)NS表達(dá)明顯減弱(P<0.05)。而其余四組之間NS染色陽(yáng)性率無(wú)明顯差別(P>0.05)，Westernblot檢測(cè)NS表達(dá)也無(wú)明顯差別(P>0.05)。(3)裸鼠心、肝、脾、肺、腎組織行HE染色，未見明顯中毒表現(xiàn)。
　　結(jié)論：在裸鼠前列腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤模型中，PSMAe/p能在高表達(dá)PSMA的LNCap細(xì)胞中特異性驅(qū)動(dòng)sheRNA轉(zhuǎn)錄，靶向干擾NS基因。Tf-PEG-PEI