糖尿病神經(jīng)病理痛C-纖維的傳導丟峰——DRG小細胞電生理機制的研究.pdf

1、C類神經(jīng)纖維是由背根神經(jīng)節(jié)（dorsalrootganglion，DRG）小細胞所發(fā)出的無髓鞘神經(jīng)纖維，它的終端可以感受外界刺激并將這種刺激轉(zhuǎn)化為電信號傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)。動作電位（actionpotential，AP）在該類神經(jīng)纖維上不存在跳躍式傳遞，所以C類神經(jīng)纖維的傳導速度較慢，所產(chǎn)生的AP帶有幅度較大并且時程較長的后作用，即AHP（afterhyperpolarizationpotential）。早在1997年，我們實驗室就發(fā)現(xiàn)

2、C類神經(jīng)纖維在發(fā)生動作電位之后有個傳導速度變化的變速時相。之后又有許多研究發(fā)現(xiàn)C類纖維的傳導速度具有的活動依賴性，在傳導過程中，該纖維上的放電序列會因外界刺激的影響而改變。然而在C類纖維傳遞電信號的過程中，這類神經(jīng)纖維的功能僅是忠實的傳遞電信號，還是對這些信號會有所加工，到目前為止尚無明確定論。
　　我們實驗室在正常兔子隱神經(jīng)的C類神經(jīng)纖維上研究發(fā)現(xiàn)，該類神經(jīng)纖維具有多種傳導模式，在給予不同頻率的電刺激后，此類神經(jīng)纖維會在傳導過程

3、中出現(xiàn)傳導丟峰現(xiàn)象（conductionfailure），并且在AP傳遞的纖維上給予鈉、鉀通道阻斷劑后，可以翻轉(zhuǎn)這種傳導丟失現(xiàn)象。
　　在AP的傳遞過程中，AP很大程度上會受到C類纖維膜結構的影響。因此在生理狀態(tài)下和病理狀態(tài)下，C類纖維會產(chǎn)生截然不同的信號傳導形式。因此，我們在病理模型上進行了預實驗，發(fā)現(xiàn)在糖尿病神經(jīng)病理性痛（painfuldiabeticneuropathy，PDN）大鼠模型上，C類纖維傳導過程中丟峰明顯減少。為

4、了進一步闡明這種傳導丟峰的產(chǎn)生機制，遂進行了以下研究：（1）觀察PDN模型大鼠C類神經(jīng)纖維上傳導丟峰的各種特征和規(guī)律；（2）通過研究DRG胞體的興奮性變化和電流機制來反映其軸突；（3）觀察胞體與軸突上與興奮性相關的離子通道的表達。本實驗主要針對第二部分內(nèi)容進行研究。
　　由于胞體及其發(fā)出的軸突是一個整體，并且軸突所需的大分子物質(zhì)，如各種膜蛋白和受體等均由胞體合成并運輸至軸突。而現(xiàn)有的實驗技術還不能實現(xiàn)對軸突上各種離子通道進行電生理

5、記錄，所以我們在實驗中通過研究胞體的電生理特點來反映軸突的變化。
　　本課題旨在闡明糖尿病神經(jīng)病理性痛模型中C類纖維上APs傳導丟失減少的電生理機制。實驗中我們選用了以外周細小神經(jīng)受累為主的PDN模型進行研究。我們對小直徑神經(jīng)元的興奮性以及相關的離子通道進行了詳細的分析。在興奮性測量中，選用動作電位的發(fā)放閾值、動作電位的半寬以及放電頻率等指標來反映興奮性變化。為了研究AP的后作用變化，我們進一步觀察了AHP的各種特征，并針對感受傷

6、害性刺激的神經(jīng)元進行研究。選用參與調(diào)控興奮性的鈉、鉀電流進行研究，針對與AP的幅度和上升支關系密切的快鈉電流，與AP的閾值和放電頻率有關的持續(xù)性鈉電流以及A型鉀電流進行研究。
　　本課題主要包括以下三部分：
　　第一部分：糖尿病神經(jīng)病理性痛動物模型的建立以及痛行為學的檢測
　　選用STZ誘導的糖尿病大鼠模型進行研究，并采用行為學手段篩選出痛覺敏化的動物進行試驗。從而保證實驗對象處于實驗目的所要求的神經(jīng)病理痛狀態(tài)。在實驗

7、過程中，我們改良了原有的造模方法，采用皮下注射STZ的方法來誘導糖尿病。
　　主要結果:
　　1.STZ注射后第3天，絕大部分的大鼠血糖增高至31±2.1mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多尿、體重下降等癥狀。這種高血糖狀態(tài)持續(xù)整個測量過程（20d），而對照組大鼠的血糖始終維持在正常水平。
　　2.糖尿病組的大鼠逐漸出現(xiàn)機械刺激痛覺敏化。實驗中觀測給藥后4d、8d、14d、24d和34d五個時間點的行為學指標，大鼠的左、右雙足

8、都出現(xiàn)了明顯的痛覺敏化。給藥兩周后，機械刺激足縮反應閾值（PWT）趨于穩(wěn)定，左足為4.37±0.47g，右足為3.75±0.62g。
　　3.糖尿病組的大鼠逐漸出現(xiàn)熱刺激痛覺敏化。給藥兩周后，糖尿病組達到穩(wěn)態(tài)水平，其熱刺激足縮反應潛伏期（PWL）為：左側足6.72±0.98s，右側足7.16±0.63s。
　　結論：
　　1.皮下注射STZ所誘導的糖尿病動物模型，成功的模擬了糖尿病血糖升高，多尿等主要癥狀，提示此方法造

9、模成功。
　　2.糖尿病模型的痛行為學檢測結果表明，PWT下降，PWL縮短，發(fā)生了外周傷害性感受器的敏化。
　　第二部分：糖尿病神經(jīng)病理性痛DRG小細胞興奮性的改變
　　針對DRG辣椒素(capsaicin)敏感的小直徑神經(jīng)元進行測量，并根據(jù)實驗結果篩選糖尿病組中具有高頻放電反應的細胞進行詳細分析。為了闡釋C類纖維上的傳導丟峰的機制，我們重點分析了興奮性和AHP的變化。并使用藥理學手段對引起興奮性增高的潛在的電流機制進

10、行了探討。
　　主要結果:
　　1.糖尿病組神經(jīng)元的AP幅度增高（111.7±2.12mV），閾值偏向超級化水平（-16.28±2.19mV），半寬（1.71±0.16ms）以及該AP的最大上升斜率（115.73±15.31mV/ms）的數(shù)值均提示糖尿病小細胞的興奮性與正常小細胞相比顯著增高。另外糖尿病狀態(tài)下DRG小細胞的放電頻率明顯增高。
　　2.選細胞產(chǎn)生第一個AP的電流基強度的1.5倍刺激水平進行觀察，經(jīng)統(tǒng)計分析

11、，把放電個數(shù)>5個/500ms的神經(jīng)元定義為高頻放電，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生高頻放電的細胞約占總數(shù)的30％。
　　3.高頻放電的神經(jīng)元中，根據(jù)它們的放電特點又可以將其分為兩類，一種是低基強度即可誘發(fā)的高頻放電細胞，<200pA的輸入電流即可引發(fā)高頻放電；另一種是較高基強度誘發(fā)的高頻放電細胞。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，低基強度的高頻放電細胞對低濃度的河豚毒素（tetrodotoxin）不敏感，然而高基強度的高頻放電細胞對100nMTTX極為敏感，低濃度的T

12、TX基本上可以完全抑制其重復放電。這些高基強度激活的高頻放電細胞可以對capsaicin產(chǎn)生去極化反應，說明這些細胞是與疼痛的產(chǎn)生有著直接關系的傷害性感受細胞。
　　4.對糖尿病狀態(tài)下高頻放電的神經(jīng)元所產(chǎn)生的AHP進行分析，發(fā)現(xiàn)不論在單個刺激下還是串刺激下，AHP的峰值均減小，半寬縮短，時程縮短。從而也認為糖尿病組中神經(jīng)元所產(chǎn)生的第一個AP對其之后要產(chǎn)生的第二個AP影響減小，更利于重復放電的發(fā)放。
　　5.在AHP產(chǎn)生后的第

13、100ms處給予一個逐步遞增的短小的電流刺激，發(fā)現(xiàn)糖尿病病變后細胞在注入較小電流即可誘發(fā)產(chǎn)生第二個AP，而對照組則需要較大的輸入電流。
　　結論：
　　1.糖尿病神經(jīng)病理痛，DRG小細胞的興奮性增高，主要表現(xiàn)為AP幅度增大、半寬縮短和閾值降低，且放電頻率增高。
　　2.在糖尿病神經(jīng)病理痛DRG小細胞中，有30％的細胞可以產(chǎn)生高頻放電（>5個/500ms），其中部分由高基強度電流誘發(fā)的高頻放電細胞是傷害性感受細胞。這類高

14、頻放電細胞的AHP的主要特征也發(fā)生了顯著性的變化，后作用相對減小。
　　第三部分糖尿病神經(jīng)病理性痛小細胞通道電流的變化
　　糖尿病神經(jīng)病理痛DRG上的傷害性感受神經(jīng)元興奮性明顯增高，但這種興奮性變化的發(fā)生是基于哪些通道電流，目前尚無定論。在本部分，我們選擇了參與AP形成的鈉、鉀電流進行研究，不僅分析了它們的電流成分和大小，還對它們的多種動力學特征進行闡釋。之后還著重分析了與AHP、重復放電以及AP閾電位水平有著密切關系的緩慢

15、失活的鉀電流（IAS）和持續(xù)性鈉電流（INaP）。
　　主要結果:
　　1.與正常細胞相比，糖尿病DRG小細胞上的INaT明顯增大。該電流的電流I-V曲線表明，糖尿病細胞的峰電流出現(xiàn)在偏向超級化的電壓水平。在糖尿病狀態(tài)下，該電流的激活和失活曲線均明顯左移。糖尿病細胞的失活時間常數(shù)和激活時間常數(shù)均減小。
　　2.將TTX-S和TTX-R的快鈉電流進行分離，并分別進行比較。發(fā)現(xiàn)糖尿病組TTX-R電流的電流密度以及TTX-S

16、電流的電流密度均明顯增大。
　　3.分別用斜波刺激和方波刺激的方法，對總的INaP和對低濃度TTX敏感的INaP進行分析。糖尿病小細胞上總的INaP和對低濃度TTX敏感的INaP均明顯增大。
　　4.測量DRG小細胞上的全鉀電流和緩慢失活的A型鉀電流（IAS）。發(fā)現(xiàn)不論是峰值電流還是穩(wěn)態(tài)期，兩種電流在糖尿病細胞上均明顯減小。
　　5.在糖尿病狀態(tài)下，全鉀電流中的峰值電流激活曲線明顯左移；穩(wěn)態(tài)電流激活曲線則僅有小幅度的變

17、化。激活時間常數(shù)明顯減小，慢失活時間常數(shù)在低電壓水平明顯減小。
　　6.在糖尿病細胞上，IAS激活曲線和失活曲線均明顯左移，穩(wěn)態(tài)期電流的激活曲線則未見明顯改變。激活時間常數(shù)明顯減小，慢失活時間常數(shù)明顯減小。
　　結論：
　　1.糖尿病神經(jīng)病理痛DRG小細胞上總的INaT電流增大；總的INaT電流的激活和失活的各種動力學特性也發(fā)生了相應的變化。糖尿病后TTX-S和TTX-R的鈉電流均增大，以TTX-R的鈉電流增大的更為顯

18、著。
　　2.糖尿病神經(jīng)病理痛DRG小細胞上總的INaP電流增大，并首次研究了DRG小細胞上對低濃度TTX敏感的INaP電流，該電流在糖尿病后增大。
　　3.糖尿病后DRG小細胞上的全鉀電流和緩慢失活的A型鉀電流均明顯減小。另外，與此相關的各種動力學特性也發(fā)生了相應改變。
　　主要結論：
　　1.本研究首次發(fā)現(xiàn)糖尿病神經(jīng)病理痛，有30％的DRG小細胞產(chǎn)生高頻放電。
　　2.這些高頻放電細胞中，大部分為高基強