利用熒光原位雜交對(duì)人類植入前胚胎行性別診斷的研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分： 目的：以昆明(KM)小白鼠體外受精(IVF)胚胎為研究對(duì)象，嘗試應(yīng)用激光法活檢鼠胚，探討活檢技術(shù)對(duì)胚胎早期發(fā)育的影響。 方法：對(duì)促排卵獲取的小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精和培養(yǎng)，然后用激光法活檢收集的4細(xì)胞和8細(xì)胞胚胎，最后觀察活檢后胚胎的發(fā)育情況。 結(jié)果： 1.共獲卵母細(xì)胞360枚，受精率和卵裂率分別為92.0％和94.3％。 2.4-細(xì)胞胚胎活檢組的囊胚形成率

2、及孵出囊胚率分別為76.6％和65.6％，8-細(xì)胞胚胎活檢組的囊胚形成率及孵出囊胚率為70.4％和59.3％，分別與未活檢對(duì)照組相比，差異無顯著性(P>0.05)；4-細(xì)胞活檢組和8-細(xì)胞活檢組的囊胚形成率及孵出囊胚率間相比較，也無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：:激光法對(duì)小鼠4細(xì)胞或8細(xì)胞胚胎進(jìn)行單卵裂球活檢，不影響胚胎的后期發(fā)育，是一項(xiàng)有效的胚胎卵裂球活檢方法。 第二部分： 目的：以人類多精受精胚胎單卵裂

3、球?yàn)閷?duì)象，對(duì)傳統(tǒng)低滲固定法進(jìn)行改良，探討一種更簡便效率更高的固定方法。 方法：收集30枚人類多精受精胚胎激光打孔后去除透明帶，將獲得的完整卵裂球按傳統(tǒng)低滲固定法和直接固定法進(jìn)行固定后行X,Y染色體雙色熒光原位雜交，比較固定率和雜交率。 結(jié)果： 1.固定卵裂球共171枚。低滲固定法(A組)固定80枚，成功68枚，成功率為85.0％。直接固定法(B)組固定91枚，成功82枚，成功率為90.1％。兩組有顯著性差異。

4、 2.A組雜交率為77.5％(/每卵裂球數(shù))，91.2％(/每核數(shù))，B組雜交率為83.5％(/每卵裂球數(shù))92.7％(/每核數(shù))。兩組無顯著性差異。 結(jié)論：直接固定法簡化了固定步驟，降低了細(xì)胞丟失率，為較理想的單個(gè)卵裂球間期核固定技術(shù)。 第三部分： 目的：應(yīng)用雙色熒光原位雜交技術(shù)分析植入前胚胎性染色體，為植入前遺傳學(xué)診斷的臨床開展建立性別診斷的技術(shù)。 方法：將激光活檢法活檢出的卵裂球用直接固定法固定

5、，然后應(yīng)用熒光原位雜交進(jìn)行性別診斷。FISH步驟包括變性、雜交、洗脫和熒光顯微鏡觀察結(jié)果進(jìn)行分析等。用淋巴細(xì)胞作為對(duì)照分析。 結(jié)果： 1.對(duì)40枚人類卵裂期胚胎進(jìn)行了活檢，成功活檢36枚，破壞胚胎4枚，活檢成功率為90％(36/40)。 2.對(duì)90枚卵裂球進(jìn)行固定，其中83枚被成功固定，固定成功率為92.2％。 3.對(duì)固定成功的83枚卵裂球細(xì)胞行雙色FISH性別鑒定，78枚細(xì)胞見到熒光信號(hào)，雜交率為94.

6、0％?；顧z的40枚胚胎中有34枚獲得了可分析FISH結(jié)果，占活檢胚胎的85％(34/40)，占成功活檢胚胎的94.4％(34/36)。34枚有FISH結(jié)果的人類早期胚胎中，其中10枚為正常女性胚胎，14枚為正常男性胚胎，8枚為性染色體嵌合型胚胎。 4.共計(jì)數(shù)間期核或中期相細(xì)胞核200個(gè)，198個(gè)細(xì)胞核見雜交信號(hào)。 結(jié)論： 1.激光法可用于人類胚胎活檢。 2.熒光原位雜交技術(shù)可快速高效，準(zhǔn)確地對(duì)人類植入前胚