毒蕈堿受體3抗原表位多肽在干燥綜合證中的意義研究.pdf

1、干燥綜合征(SS)是一種以淋巴細胞等細胞侵犯淚腺、唾液腺等外分泌腺為主的，以自身抗體為介導的慢性全身性自身免疫性疾病，在我國的患病率為0.77％。目前該疾病的詳細發(fā)病機制尚未明確闡述，認為該疾病的發(fā)生是由多因素引發(fā)的，包括遺傳、病毒感染、自身免疫等，其中自身抗原在干燥綜合征的發(fā)生中具有重要作用。近十年來許多研究包括我們的工作陸續(xù)發(fā)現(xiàn)抗毒蕈堿受體3(M3R)抗體是干燥綜合征特異性抗體之一，在臨床診斷上具有較高的敏感度和特異性。在自身免疫病

2、患者機體免疫應答過程中，自身抗原被降解為多肽與主要組織相容性復合物(MHC)結合，進而引起相關免疫學反應，因此研究自身抗原表位多肽在SS發(fā)生中的作用具有直接的重要意義。基于以上原因，首先利用計算機模擬以及Westernblot、ELISA等免疫學方法從三條M3R抗原表位多肽(N49，N251和N412)中篩選得到一條抗原表位多肽(N49)，進一步通過檢測干燥綜合征動物模型中抗N49多肽抗體和免疫N49多肽來更全面的了解M3R及其抗原表位

3、在干燥綜合征發(fā)生中的作用。從以下三個方面進行了相關研究。 1.毒蕈堿受體3抗原表位篩選及其在原發(fā)性干燥綜合征診斷中的作用運用計算機軟件分析毒蕈堿受體3(M3R)蛋白的結構特點及抗原決定簇分布，根據(jù)結果設計合成3條多肽。比較合成多肽與抗M3受體抗體陽性干燥綜合征(SS)患者血清IgG的反應強弱，獲得一條抗原抗體反應最強的抗原表位多肽(N49)。進一步以多肽N49作為包被抗原，檢測原發(fā)性SS(pSS)患者41例，繼發(fā)SS(sSS)患

4、者25例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者34例，類風濕性關節(jié)炎(RA)患者80例和正常人174份血清中抗M3多肽IgG抗體，結果顯示該多肽抗體在原發(fā)性SS患者血清中的陽性率為53.7％，明顯高于sSS患者28％、SLE患者8.8％、RA患者25％和正常人12.1％?？筃49多肽抗體在原發(fā)性SS診斷中的敏感性為53.7％，特異性為83.7％，而且該抗體的檢測對于抗SSA抗體、抗SSB抗體或抗α-胞襯蛋白(α-fodrin)抗體陰性的原發(fā)性S

5、S患者的診斷具有補充作用。表明，篩選獲得的M3抗原表位多肽N49，其檢測抗體在原發(fā)性SS臨床血清診斷中具有很好的應用價值。 2.抗毒蕈堿受體3抗原表位多肽抗體在干燥綜合征動物模型發(fā)生中的意義頜下腺組織勻漿誘導型干燥綜合征動物模型是最常用的干燥綜合征動物模型之一，為探討抗毒蕈堿受體3(M3R)抗原表位多肽抗體在干燥綜合征(SS)小鼠模型發(fā)生中的意義，利用頜下腺組織勻漿與百日咳疫苗誘導小鼠SS動物模型，以生理鹽水免疫小鼠作為對照組，

6、檢測各組小鼠血清中抗M3R3條抗原表位多肽(N49、N251和N412)抗體，抗α-fodrin抗體和抗SSA/SSB抗體滴度及頜下腺淋巴細胞浸潤情況。結果顯示頜下腺組織勻漿免疫組小鼠血清中存在抗M3R多肽抗體，抗M3R表位多肽N49、N251、N412抗體，抗α-fodrin抗體和抗SSA抗體陽性率分別為90％(18/20)、95％(19/20)、95％(19/20)、90％(18/20)和50％(10/20)，但是為檢測到抗SSB抗

7、體。M3R的三條多肽中N49多肽與血清反應OD值最大；有7只(7/20)小鼠頜下腺出現(xiàn)淋巴細胞浸潤現(xiàn)象。對照組小鼠血清抗M3R3條多肽抗體均為陰性，抗α-fodrin抗體和抗SSA陽性率皆為10％(2/20)，而且有2只(2/20)出現(xiàn)輕度頜下腺淋巴細胞浸潤。表明抗M3多肽抗體存在于該小鼠SS模型中，是干燥綜合征發(fā)生因素之一。為了進一步了解N49表位在干燥綜合征發(fā)生中的作用，將通過免疫該多肽的方式進行下一步的研究。 3.毒蕈堿受

8、體3抗原表位多肽(N49)誘導干燥綜合征動物模型的研究利用毒蕈堿受體3(M3R)抗原表位多肽N49免疫BALB/c小鼠，以生理鹽水注射小鼠作為對照組，檢測各組小鼠血清抗N49多肽抗體和頜下腺淋巴細胞浸潤情況。結果顯示多肽免疫組小鼠血清抗N49多肽抗體陽性率達100％(20/20)，其中有7只(7/20)小鼠出現(xiàn)頜下腺淋巴細胞浸潤；對照組小鼠血清抗N49多肽抗體均為陰性，僅有2只(2/20)出現(xiàn)頜下腺淋巴細胞浸潤。進一步以M3R不同抗原表

9、位多肽N251和N412以及另三種自身抗原α-胞襯蛋白(α-fodrin)、SSA和SSB為包被抗原，檢測以上實驗小鼠血清中的抗體情況，顯示第70天時N49多肽免疫組小鼠血清中抗N251和N412多肽抗體以及抗α-fodrin抗體和抗SSA/SSB抗體陽性率分別為100％(20/20)、85％(17/20)、90％(18/20)，35％(7/20)和20％(4/20)，而對照組小鼠血清中抗N251、N412多肽抗體和抗SSB抗體均為陰性