薯蕷皂素調(diào)控ESR及其ERK-Akt信號(hào)通路促進(jìn)SCs增殖的機(jī)制研究.pdf

1、薯蕷皂素（Diosgenin）來(lái)源于薯蕷科單子葉草質(zhì)纏繞藤本植物，如山藥、黃姜、黃藥子、穿山龍等的根莖，是生產(chǎn)氫化可的松、強(qiáng)的松、炔諾酮、膚輕松、地塞米松等多種甾體類(lèi)藥物的重要基礎(chǔ)原料。研究表明，薯蕷皂素具有抗氧化、抗血管鈣化、抗腫瘤、抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒和抗休克等作用；但在生殖方面的研究，報(bào)道甚少，有研究初步證實(shí)，薯蕷皂素能夠改善輕度雄性衰老性生殖障礙，提高精子活性；但薯蕷皂素對(duì)睪丸支持細(xì)胞（Sertoli cells，SCs）作用的

2、研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，進(jìn)一步研究薯蕷皂素對(duì)雄性生殖的影響，可能為男性不育防治提供新的思路。
　　SCs在精子生成過(guò)程中，可以在近基底室建立一個(gè)提供結(jié)構(gòu)支撐、營(yíng)養(yǎng)和免疫保護(hù)的獨(dú)特和重要的環(huán)境，具有營(yíng)養(yǎng)支持、分泌、免疫豁免及吞噬等多種功能。由于雌激素在維持雄性生殖活動(dòng)中具有不可替代的作用。SCs是未成熟動(dòng)物雌激素的主要來(lái)源，雌激素不僅可以直接促進(jìn) SCs的增殖、分化和成熟，而且可以通過(guò)間接影響促卵泡生成素（follicle-stimu

3、lating hormone，F(xiàn)SH）的分泌，調(diào)節(jié) SCs有絲分裂；同時(shí)，又由于雌激素主要是通過(guò)其受體（Estrogen receptor，ESR）信號(hào)通路來(lái)完成調(diào)控男性精子生成的作用。因此，研究薯蕷皂素對(duì)SCs的作用及其對(duì) ESR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的影響，不僅為探討該藥治療男性不育的作用及機(jī)制，而且為其進(jìn)一步藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分：薯蕷皂素對(duì)SCs增殖的影響
　　目的：
　　通過(guò)觀察薯蕷皂素干預(yù)后，小鼠睪丸來(lái)

4、源的SCs（TM4）細(xì)胞系的增殖、周期分布及凋亡，探討薯蕷皂素對(duì) SCs增殖的影響。
　　方法：
　　1) MTT法及 Brdu法檢測(cè)薯蕷皂素干預(yù)后，SCs（TM4）的增殖情況。
　　2)流式細(xì)胞術(shù)及Western Blot法檢測(cè)薯蕷皂素干預(yù)后，SCs（TM4）的周期分布及G0/G1期標(biāo)志蛋白 CDK4/CDK6、cyclin D1、CDK2、cyclin E與G2/M期標(biāo)志蛋白 cdc2、cyclin B的表達(dá)。

5、r>　　3) TUNEL法及 Western Blot法檢測(cè)薯蕷皂素對(duì)干預(yù)后，SCs（TM4）凋亡及凋亡相關(guān)蛋白 Bax、AIF、Caspase3、Caspase9和Bcl-2的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1)不同薯蕷皂素濃度均可促進(jìn) SCs（TM4）增殖（P<0.05），以2.5μM最為顯著；2.5μM薯蕷皂素干預(yù) SCs（TM4）6-48 h，在6、12、24、48 h等不同時(shí)間點(diǎn)均可見(jiàn)細(xì)胞活力增加（P<0.05），但以24

6、h時(shí)達(dá)最大值。
　　2)2.5μM薯蕷皂素干預(yù) SCs（TM4）24h，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P<0.05），而 S期的細(xì)胞群顯著增加（P<0.05），G2/M期細(xì)胞群沒(méi)有顯著改變（P>0.05）；G0/G1期的標(biāo)志蛋白 CDK4/CDK6、Cyclin D1、CDK2與Cyclin E表達(dá)明顯增加（P<0.05），而 G2/M期標(biāo)志蛋白 cdc2和Cyclin B表達(dá)無(wú)顯著影響（P>0.05）。 CDKs抑制因子 P27

7、的表達(dá)稍有下降（P>0.05）。
　　3)2.5μM薯蕷皂素干預(yù) SCs（TM4）24 h，能顯著抑制細(xì)胞凋亡（P<0.05）；明顯抑制凋亡相關(guān)因子 Bax、AIF、Cleaved Caspase3和Cleaved Caspase9的表達(dá)，增加 Bcl-2蛋白表達(dá)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　薯蕷皂素能夠促進(jìn)小鼠 SCs（TM4）的增殖，且存在一定的量效與時(shí)效關(guān)系；同時(shí)促進(jìn)其細(xì)胞周期過(guò)渡和抑制其凋亡。
　　

8、第二部分：薯蕷皂素調(diào)控ESR及其ERK/Akt信號(hào)通路促進(jìn)SCs增殖的機(jī)制
　　目的：
　　通過(guò)觀察薯蕷皂素對(duì) SCs（TM4)中 ESR及其 ERK/Akt信號(hào)通路的影響，探討其促進(jìn) SCs增殖的機(jī)制。
　　方法：
　　1)以2.5μM薯蕷皂素干預(yù)，及在此基礎(chǔ)上分別加入1nM抗雌激素 ICI和5nM酪氨酸激酶選擇性抑制劑 PP2，Western Blot法檢測(cè) SCs（TM4）核和質(zhì)膜中的 ESR1、ESR2的

9、蛋白表達(dá)。MTT和Brdu標(biāo)記法、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL法檢測(cè) SCs（TM4）的增殖、周期分布及凋亡。
　　2)薯蕷皂素干預(yù) SCs（TM4）后，及在薯蕷皂素干預(yù)的基礎(chǔ)上，分別加入 ICI、PP2及ERK抑制劑 U0126及和Akt抑制劑LY294002后，Western Blot法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)ERK和Akt磷酸化；MTT和Brdu標(biāo)記法檢測(cè)SCs（TM4）的增殖。
　　3)薯蕷皂素干預(yù)后，采用Wstern Blot法檢

10、測(cè)SCs（TM4）細(xì)胞核上 ESR表達(dá)；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) SCs（TM4）的 ESR的轉(zhuǎn)錄活性。
　　4) CHIP檢測(cè)薯蕷皂素干預(yù)后，SCs（TM4） ESR的晚期活動(dòng)。
　　結(jié)果：
　　1)2.5μM薯蕷皂素干預(yù) SCs（TM4）0-30min，在5min、15min、30min時(shí)間點(diǎn)質(zhì)膜上 ESR1和ESR2蛋白表達(dá)均有顯著升高（P<0.05），在15min時(shí)達(dá)到最高；而核上ESR1和ESR2的蛋白表達(dá)顯著降

11、低（P<0.05），在15min時(shí)達(dá)到最低。加入 ICI和PP2時(shí)，ESR1、ESR2細(xì)胞膜表達(dá)水平受到了顯著抑制（P<0.05）；而細(xì)胞核上 ESR1、ESR2的核表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。在加入 ICI和PP2時(shí)，薯蕷皂素促進(jìn) SCs（TM4）增殖的作用受到了顯著的抑制（P<0.05）；同時(shí)，G0/G1期細(xì)胞群數(shù)量有明顯上升（P<0.05），S期的細(xì)胞群數(shù)量有明顯下調(diào)（P<0.05）；細(xì)胞的凋亡有顯著增加（P<0.05）。<

12、br>　　2)2.5μM薯蕷皂素干預(yù)SCs（TM4）0-30min，在5min、15min、30min時(shí)均可增加 ERK、Akt磷酸化水平，15min時(shí)達(dá)到最高（P<0.05）。分別加入相關(guān)抑制劑ICI、PP2、U0126及LY294002時(shí)，ERK、Akt磷酸化水平受到顯著抑制（P<0.05）；加入U(xiǎn)0126及LY294002時(shí)，SCs（TM4）的細(xì)胞增殖降低（P<0.05）。
　　3)2.5μM薯蕷皂素干預(yù)0-48h，在12h

13、、24h、48h時(shí)間點(diǎn) SCs（TM4）細(xì)胞核ESR1與ESR2的表達(dá)增加，其中以干預(yù)后24h增加最為顯著（P<0.05）；在此基礎(chǔ)上加入PP2時(shí)，細(xì)胞核上 ESR1、ESR2的核表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；同樣條件下，SCs（TM4）的 ESR轉(zhuǎn)錄活性顯著增加（P<0.05），以干預(yù)后24h增加最為顯著；而在加入抑制劑ICI、PP2、U0126和LY294002后SCs（TM4）的 ESR轉(zhuǎn)錄活動(dòng)受到顯著抑制（P<0.05）。<

14、br>　　4)2.5μM薯蕷皂素干預(yù)SCs（TM4）后 ESR1、ESR2蛋白分子與Cyclin D1及Bcl-2基因結(jié)合水平增高顯著（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　薯蕷皂素促進(jìn) SCs（TM4）增殖機(jī)制：干預(yù)后激活依賴(lài)于 SRC誘導(dǎo)的即時(shí)和瞬態(tài) ESR核質(zhì)膜易位，隨后激活 ERK/Akt信號(hào)通路，后期通過(guò)活化核 ESR的轉(zhuǎn)錄活性和直接調(diào)控細(xì)胞周期因子 cyclin D和細(xì)胞凋亡因子 Bcl-2，從而促進(jìn) G1期到 S期