人外周血來源內(nèi)皮祖細胞（EPC）轉染自殺基因CD-UPRT治療惡性膠質瘤的體外研究.pdf

1、惡性膠質瘤是常見的顱腦腫瘤，也是血管最豐富的人類實體腫瘤之一。由于具有較強的侵襲性和易復發(fā)，惡性膠質瘤的治療至今仍難以攻克。在許多針對惡性膠質瘤的實驗治療方法中，有些方法已通過體外和動物體內(nèi)實驗的驗證，并進入臨床試驗。但迄今的結果證明，這些方法仍不能根本改變這一惡性腫瘤的致命轉歸。近十余年來，有關腫瘤分子生物學與分子遺傳學研究進一步深化，闡明了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個多因素、多基因、多階段的復雜過程，也提示對腫瘤綜合治療的理念和方法也應多

2、渠道，多靶點，多時相。 我們實驗設想是，通過對經(jīng)外周血誘導培養(yǎng)得到的EPCs進行基因修飾，使其攜帶聯(lián)合自殺基因CD-UPRT(cytosinedeaminase-uracilphosphoribosyltransferase)；EPCs對腫瘤血管具有趨向性，可以到達腫瘤部位并原位整合入腫瘤血管內(nèi)皮，彌散入腫瘤實質[1]；給予前體藥物后，EPCs發(fā)生凋亡，破壞腫瘤血管生成；同時EPCs凋亡而產(chǎn)生的旁觀者效應進一步殺傷腫瘤細胞。實驗

3、將探討以腫瘤血管和腫瘤細胞為雙重靶點聯(lián)合應用抗血管生成療法和自殺基因療法的可行性。本研究將重點完成外周血分離誘導培養(yǎng)EPCs并對其進行基因修飾；觀察經(jīng)CD-UPRT基因修飾的EPCs對前體藥物5-FC的反應性及旁效應對惡性膠質瘤細胞的體外殺傷作用。研究結果將為進一步的實驗研究提供了理論和實驗依據(jù)。 將外周血經(jīng)密度梯度離心得到的單個核細胞，用含有誘導因子的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基EGM-2體外誘導培養(yǎng)。在培養(yǎng)第7天時大部分細胞拉長呈梭形，部

4、分細胞呈極性排列，并有克隆集落形成，說明所得細胞已開始向內(nèi)皮細胞分化；吞噬ac-LDL(acetylated-low-densitylipoprotein)并與UEA-1(ulexeuropaeusagglutinin)結合證實了其具有內(nèi)皮細胞表型；免疫熒光檢測到CD34、CD133、VEGFR-2的表達，流式細胞儀檢測各種指標陽性細胞比例為：CD34+占37.645％，CD133+占45.655％，VEGFR-2+占57.3％，其中C

5、D34+與CD133+雙陽性細胞占29.44％，CD34+與VEGFR-2+雙陽性細胞占28.38％。體外誘導培養(yǎng)可使EPCs較培養(yǎng)初期擴增近100倍。通過粘附和Transwell實驗證明了所得細胞有良好的粘附能力和向VEGF等趨化因子的遷移能力。接著我們用脂質體轉染法將攜帶聯(lián)合自殺基因CD-UPRT真核表達載體pCEACDCAUP轉入EPCs內(nèi)，并通過RT-PCR法檢測到經(jīng)轉染的細胞群有自殺基因CD及UPRT的mRNA表達。

6、為了進一步證明經(jīng)轉染的EPCs表達CD-UPRT基因，我們觀察了不同濃度5-FC對經(jīng)基因修飾后EPCs細胞群以及野生型EPCs活性的影響，將5-FC系列稀釋后加入培養(yǎng)基中作用72h，發(fā)現(xiàn)兩者對5-FC的反應有明顯差異。當5-FC系列稀釋濃度在0.001～1000μg/ml時，對野生型EPCs無明顯毒性作用，但是5-FC為10μg/ml時，經(jīng)基因修飾的EPCs群的存活率就已低于50％，100μg/ml時細胞大部分死亡而僅有6％存活。據(jù)此，

7、我們將100μg/ml作為旁效應研究中的5-FC給藥濃度。 在旁效應觀察實驗中，我們將基因修飾的EPCs群和膠質瘤細胞U251按不同比例混合后共培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入100μg/ml5-FC，72小時后觀察細胞生長抑制率。發(fā)現(xiàn)各種混合比例組的細胞生長抑制率皆大于基因修飾型EPCs群所占的比例，提示有旁效應發(fā)生，且旁效應隨著基因修飾型EPCs群比例的增加而放大。當基因修飾型EPCs群與U251比例為1:1時，旁效應明顯，細胞生長抑制率

8、高達80％以上。 綜上，在本研究中我們成功分離、擴增并鑒定了人外周血來源的EPCs。經(jīng)脂質體法轉導了CD-UPRT的EPCs細胞群有效表達CD-UPRTmRNA，并可增強前藥物5-FC對基因轉導細胞的細胞毒作用。旁效應實驗中，證明了旁效應隨基因修飾型EPCs在U251細胞中的混入比例增加而擴大；50％的基因修飾EPCs群所引發(fā)旁效應就足以殺死大部分細胞，細胞生長抑制率高達80％以上。至此，我們本研究為轉導了自殺基因CD—UPRT