α、β、γ-晶體蛋白在哺乳類動物角膜中的表達.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：α、β、γ-晶體蛋白在哺乳類動物角膜中的表達
　　 目的:角膜是如何維持其透明性的機制仍不清楚。角膜晶體蛋白(酶類晶體蛋白)在脊椎或無脊椎動物角膜中表達并在角膜的透明性中起重要作用。本實驗重點研究3種經(jīng)典晶狀體晶體蛋白(非酶類晶體蛋白)，即α、β、γ-晶體蛋白，是否參與小鼠和人類角膜的透明性。
　　 方法：利用Balb/c和C57BL/6小鼠，分別用縫線和化學(xué)燒傷誘導(dǎo)角膜新生血

2、管模型，應(yīng)用基因芯片和實時熒光定量PCR(RT-Q-PCR)技術(shù)檢測相關(guān)基因的表達變化;在角膜或培養(yǎng)的角膜細胞中，應(yīng)用RT-Q-PCR檢測晶狀體晶體蛋白和角膜晶體蛋白的mRNA表達水平，應(yīng)用免疫組化(IHC)或蛋白質(zhì)印跡法檢測他們的蛋白表達水平。
　　 結(jié)果：通過基因芯片或RT-Q-PCR技術(shù)檢測到晶體蛋白基因在角膜或培養(yǎng)的角膜細胞中豐富表達，也可以通過IHC或蛋白質(zhì)印跡法檢測到α、β、γ-晶體蛋白在角膜或培養(yǎng)的角膜細胞中表達。

3、在縫線和化學(xué)燒傷誘導(dǎo)的新生血管模型中，晶狀體晶體蛋白基因表達表現(xiàn)出時間和種屬的依賴性改變模式，且與角膜晶體蛋白的改變不同。外源性氧化或炎性刺激如H2O2和脂多糖能影響角膜細胞中晶狀體晶體蛋白的表達。
　　 結(jié)論：α、β、γ-晶體蛋白在維持哺乳動物角膜透明性起重要作用。相關(guān)機制的進一步研究將有助于揭開角膜透明性的奧秘。
　　 第二部分：小鼠角膜病變模型研究中實時熒光定量PCR最佳內(nèi)參基因的篩選
　　 目的:在幾種常

4、用的小鼠角膜病變模型中，為實時熒光定量PCR(RT-Q-PCR)篩選穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因。
　　 方法：利用Balb/c和C57BL/6小鼠建立本實驗室常用的角膜病變模型，1)、角膜新生血管模型(CorNV)，分別采用縫線和化學(xué)燒傷誘導(dǎo)的角膜新生血管模型;2)、真菌角膜炎模型，分別采用白色念珠菌和煙曲霉菌誘導(dǎo)的真菌角膜炎模型;3)、角膜貫通傷誘導(dǎo)的角膜創(chuàng)傷模型。應(yīng)用基因芯片和RT-Q-PCR檢測8個常用內(nèi)參基因(甘油三磷酸脫氫酶(

5、GAPDH),β-肌動蛋白(ACTB)、乳酸脫氫酶A(LDHA)、核糖體蛋白L5(RPL5)、泛素C(UBC)、肽基異構(gòu)酶A(PPIA)、TATA盒結(jié)合蛋白(TBP1)和次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT1)在每個模型不同時間點的表達變化清況，采用geNorm和NormFinder統(tǒng)計軟件分析RT-Q-PCR的結(jié)果。
　　 結(jié)果：基因芯片結(jié)果分析顯示，在角膜新生血管狀態(tài)下，8個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性依次:PPIA>RPL5>HPRT1>

6、ACTB>UBC>TBP1>GAPDH>LDHA。RT-Q-PCR的結(jié)果分析顯示:在8個內(nèi)參基因中，沒有一個基因在所有實驗條件下是恒定表達的，在大部分實驗條件下，GAPDH和ACTB表達最不穩(wěn)定。NormFinder和geNorm在不同角膜模型中分別推薦最佳單個內(nèi)參基因和成對內(nèi)參基因。NormFinder推薦PPIA在CorNV和PCI模型中為最佳內(nèi)參基因，UBC在真菌角膜炎模型中為最佳內(nèi)參基因。geNorm分析結(jié)果顯示，在不同模型或在

7、不同品系小鼠建立同一模型中，其最佳內(nèi)參基因就不一樣。在CorNV in Balb/c和C57BL/6模型中，GeNorm分別推薦PPIA&HRPT1和PPIA&RPL5作為最佳內(nèi)參基因;白色念珠菌和煙曲霉菌誘導(dǎo)的真菌角膜炎模型中，GeNorm分別推薦UBC&HPRT1和UBC&LDHA作為最佳內(nèi)參基因。
　　 結(jié)論：在進行角膜相關(guān)研究，為RT-Q-PCR選取最佳內(nèi)參基因有利于角膜相關(guān)表達基因的研究;在沒有最適內(nèi)參基因的情況下，可