截短型人骨保護(hù)素哺乳類(lèi)載體的構(gòu)建、優(yōu)化及表達(dá).pdf

1、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)是破骨細(xì)胞分化因子(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand，RANKL)的可溶性“誘騙”受體，能抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟、活化及存活。它是一種分泌性糖蛋白，含21個(gè)信號(hào)肽和5個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。成熟人OPG由7個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中N-端有4個(gè)半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)，也是其生物活性所在部位。最初OPG以單體形式在細(xì)胞內(nèi)生成，再在第400個(gè)半胱氨酸(Cys

2、400)的位置以二硫鍵連成二聚體。 目前，雖有原核表達(dá)OPG的報(bào)道，但仍存在一些不足。例如，在大腸桿菌中表達(dá)真核蛋白，不能進(jìn)行翻譯后修飾，諸如不能完成蛋白的糖基化、磷酸化和二硫鍵的形成等，所以很難制得具備天然活性的蛋白質(zhì)。真核細(xì)胞能夠表達(dá)具有生物功能的OPG，但存在的普遍問(wèn)題是表達(dá)量不高。近年本室成功構(gòu)建了OPG的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/DHFR-OPG，轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細(xì)胞后獲得了表達(dá)，但表達(dá)量不高，不能滿足后續(xù)實(shí)

3、驗(yàn)的需要。本次研究在于進(jìn)一步優(yōu)化已建立好的表達(dá)系統(tǒng)，并進(jìn)一步對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫原性鑒定和生物活性測(cè)定。 本次研究將通過(guò)對(duì)目的基因和載體結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)，以達(dá)到優(yōu)化表達(dá)的目的。在已有全長(zhǎng)型人OPG重組哺乳類(lèi)表達(dá)載體pcDNA3.1/DHFR-OPG的基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增截短型人OPGcDNA(含有21個(gè)信號(hào)肽序列、D1-D4結(jié)構(gòu)區(qū)和形成二硫鍵必需的Cys400)，利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ將其克隆入構(gòu)建好的帶有二氫葉酸還原酶篩選

4、標(biāo)記的哺乳類(lèi)表達(dá)載體pcDNA3.1/DHFR-GFP的相應(yīng)克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成pcDNA3.1/DHFR-tOPG。并嘗試對(duì)載體進(jìn)行優(yōu)化，以截短型OPG為模板，運(yùn)用兩次PCR技術(shù)，在目的基因的5'端非翻譯區(qū)添加了一條長(zhǎng)35bp的翻譯增強(qiáng)序列和一條長(zhǎng)37bp的內(nèi)含子序列，構(gòu)建了表達(dá)載體pcDNA3.1/DHFR-netOPG。 按照LipofectmineTM2000Reagent說(shuō)明書(shū)將上述已線性化載體分別轉(zhuǎn)入二氫葉酸還原酶(Di

5、hydrofolateReductase，DHFR)基因缺陷的CHO細(xì)胞中，首先在含5％透析血清的條件培養(yǎng)基IMEM中篩選出轉(zhuǎn)染成功的陽(yáng)性克隆，經(jīng)ELISA測(cè)定篩選出的高表達(dá)細(xì)胞株，傳代后氨甲喋呤(methotrexate，MTX)梯度濃度加壓篩選。在MTX梯度濃度加壓作用下，可見(jiàn)重組蛋白的表達(dá)水平不斷增高，重組蛋白最高表達(dá)水平可達(dá)6ug/ml，但在同一濃度組優(yōu)化前后重組蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯差異(p＞0.05)。經(jīng)WesternBlott

6、ing鑒定重組蛋白有免疫原性，截短型分子量大小在37.8kD左右。采用破骨細(xì)胞樣細(xì)胞(osteoclast-likecell，OCL)誘導(dǎo)分化抑制實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定重組蛋白的生物學(xué)活性，證實(shí)重組蛋白能抑制單核/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MacrophageClony-Stimulatingfactor,MCS-F)和RANKL對(duì)多核OCL生成的協(xié)調(diào)促進(jìn)作用，OCL的生成顯著減少(p＜0.05)。對(duì)同一高表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行凍存，反復(fù)3次復(fù)蘇，重組蛋白的表