增強(qiáng)L-型鈣通道、鈉鈣交換體和鈉泵以提高心肌變力性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：臨床上處理失代償?shù)男牧λソ卟∪?，需要?yīng)用正性變力性藥物改善血流動(dòng)力學(xué)紊亂，但是目前所有變力性藥物對(duì)心肌的舒張功能均無明顯改善作用。面對(duì)心排血量不足而又有舒張功能障礙的病人，臨床中迫切需要能同時(shí)改善心肌收縮功能與舒張功能的藥物。我們對(duì)提高心肌變力性模式的設(shè)想是同時(shí)激動(dòng)心肌L-型鈣通道(L-typecalciumchannel，LCC)，Na/Ca交換體(Na/Caexchanger,NCX)和鈉泵，其中增強(qiáng)心肌LCC作為提高心肌

2、收縮功能的有效途徑，而舒張功能的改善通過激動(dòng)NCX和鈉泵來實(shí)現(xiàn)。鑒于目前在國內(nèi)外還未見同時(shí)激動(dòng)NCX、LCC和鈉泵的的實(shí)驗(yàn)或臨床研究，也未發(fā)現(xiàn)具有這一復(fù)合作用的藥物，為了驗(yàn)證我們從理論上設(shè)計(jì)的提高心肌變力性的新模式，我們嘗試?yán)每闺目贵w實(shí)現(xiàn)選擇性地同時(shí)激動(dòng)NCX、LCC和鈉泵的目的。 研究目的：(1)通過對(duì)LCC，NCX和鈉泵關(guān)鍵部位氨基酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析，設(shè)計(jì)肽段，并以此為抗原，對(duì)大鼠進(jìn)行主動(dòng)免疫，制備出抗肽抗體，然后分

3、離提純大鼠血清中的IgG。利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)各抗體對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白離子電流的影響，篩選出同時(shí)激動(dòng)鈉鈣交換體，L-型鈣通道以及鈉泵的理想抗肽抗體。(2)觀察抗肽抗體對(duì)離體大鼠心臟收縮舒張功能和冠脈阻力的影響，及其對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)張力的作用。(3)觀察抗肽抗體對(duì)單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變及細(xì)胞收縮的影響，以分析抗體對(duì)心肌變力性的作用機(jī)制。(4)觀察抗肽抗體對(duì)急性衰竭離體灌流心臟心功能的影響。 研究方法：(1)通過對(duì)LC

4、C，NCX和鈉泵關(guān)鍵部位氨基酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析，設(shè)計(jì)了多條肽段，由美聯(lián)(西安)生物科技有限公司合成。用肽段對(duì)大鼠進(jìn)行主動(dòng)免疫，采用ELISA方法對(duì)免疫后大鼠血清抗體滴度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，應(yīng)用親和層析法提取和純化抗血清中的抗體IgG，并用PAGE膠凝膠電泳對(duì)其純度進(jìn)行檢測(cè)，用考馬斯亮蘭試劑盒對(duì)抗體進(jìn)行定量。(2)分離成年大鼠及豚鼠心室肌細(xì)胞，采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法，觀察抗肽抗體對(duì)ICa-L，INCX、INapump以及INa、Ito、Ik

5、1以及Ik的影響。篩選出同時(shí)選擇性激動(dòng)ICa-L，INCX、INapump的抗肽抗體。(3)利用Langendorff心臟灌流裝置觀察抗肽抗體對(duì)離體大鼠心臟心功能和冠脈阻力的影響，并觀察在灌流期間有無心律失常的發(fā)生。(4)通過離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)，觀察抗肽抗體對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)張力的影響。(5)利用離子影像分析系統(tǒng)，觀察抗肽抗體對(duì)單個(gè)心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變及細(xì)胞長度的影響。離子影像分析系統(tǒng)記錄激發(fā)光為340nm和380nm的成對(duì)系列圖像

6、，從同一對(duì)系列計(jì)算出340nm/380nm的熒光比值(F340/F380)，并從同一系列圖像計(jì)算得到細(xì)胞長度隨時(shí)間的變化。(6)利用Langendorff心臟灌流裝置制備大鼠急性心衰模型：對(duì)離體大鼠心臟進(jìn)行灌流，先用臺(tái)氏液灌流30分鐘，穩(wěn)定后再用含0.1g/L戊巴比妥鈉的臺(tái)氏液繼續(xù)灌流，當(dāng)心肌主動(dòng)收縮力下降至原來的1/2左右時(shí)，即可認(rèn)為急性心衰模型制備成功。觀察抗肽抗體對(duì)急性衰竭離體大鼠心臟心功能的影響。 研究結(jié)果：(1)用合成

7、的肽段對(duì)大鼠進(jìn)行主動(dòng)免疫，經(jīng)過九周的主動(dòng)免疫后，各肽段組抗體滴度均顯著增長。應(yīng)用親和層析法提取和純化抗血清中的抗體IgG，PAGE膠凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，純化后的抗體在電泳時(shí)，都僅出現(xiàn)一條條帶，分子量為160KDa左右，與IgG標(biāo)準(zhǔn)品相一致，表明純化結(jié)果理想。(2)通過膜片鉗全細(xì)胞記錄法觀察到三種抗肽抗體在10nM，20nM，40nM三個(gè)濃度下對(duì)ICa-L，INCX、INapump均產(chǎn)生劑量依賴性地激動(dòng)作用，而對(duì)INa、Ito、Ikl以

8、及Ik沒有明顯影響。(3)在10nM，20nM，40nM三個(gè)濃度下，三種抗肽抗體均能劑量依賴性地使大鼠離體心臟心功能(LVSP-LVDP，+dp/dtmax，-dp/dtmax)增強(qiáng)，并且在整個(gè)給藥過程中沒有心律失常的發(fā)生。同時(shí)三種抗肽抗體對(duì)大鼠離體灌流心臟的冠脈阻力均沒有明顯影響。(4)在10nM，20nM兩個(gè)濃度下，三種抗肽抗體對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)均沒有明顯影響。在40nM濃度時(shí)，抗肽抗體1，2能夠輕微增加胸主動(dòng)脈環(huán)的張力；而抗肽抗

9、體3在該濃度下對(duì)胸主動(dòng)脈環(huán)張力仍沒有顯著作用。(5)三種抗肽抗體(40nM)可以增加單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的峰值和細(xì)胞縮短的程度，同時(shí)可以減小TP(timetopeak)，TR50(timeto50％restore)和TR90(timeto90％restore)，提示可以同時(shí)增加鈣瞬變上升和下降的速率。同時(shí)三種抗肽抗體對(duì)心肌的鈣敏感性無顯著影響，表明它們的強(qiáng)心作用與收縮蛋白鈣敏感性的變化無關(guān)。(6)在用KBR7943(10nM)預(yù)處理心肌

10、細(xì)胞后，鈣瞬變的峰值雖然有所下降，但并不明顯。同時(shí)TR90延長。這個(gè)結(jié)果與鈉鈣交換體在生理情況下主要介導(dǎo)鈣離子外排的理論相一致。再加入抗肽抗體后，鈣瞬變峰值明顯增加，而TR90不再減小，且鈣瞬變峰值增加的幅度與每個(gè)抗體對(duì)L-型鈣通道激動(dòng)作用的大小相一致。用尼卡地平(1μm)預(yù)處理心肌細(xì)胞后，鈣瞬變峰值顯著下降，TR90沒有明顯改變，提示經(jīng)L-型鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鈣離子是鈣瞬變峰值的主要決定因素。再加入抗肽抗體后，鈣瞬變峰值有增加的趨勢(shì)，

11、但并不顯著，而TR90卻明顯下降，其下降程度與每個(gè)抗體對(duì)鈉鈣交換激動(dòng)作用強(qiáng)度相一致。同時(shí)用KBR7943和尼卡地平預(yù)處理心肌細(xì)胞后，鈣瞬變的峰值下降，TR90延長，表明心肌細(xì)胞的收縮和舒張活動(dòng)都受到了抑制，再給抗肽抗體后，不產(chǎn)生改變。這個(gè)結(jié)果表明，LNN抗肽抗體對(duì)收縮和舒張活動(dòng)的影響主要是通過激動(dòng)鈉鈣交換體和L-型鈣通道來實(shí)現(xiàn)的，而激動(dòng)鈉泵對(duì)于收縮舒張活動(dòng)沒有直接的影響。(7)用含0.1g/L戊巴比妥鈉的臺(tái)氏液大鼠灌流離體心臟后，LVS

12、P-LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均顯著下降，同時(shí)冠脈阻力升高。灌流抗肽抗體均能劑量依賴性地改善大鼠急性衰竭離體心臟的心功能指標(biāo)(LVSP-LVDP，+dp/dtmax，-dp/dtmax)，在整個(gè)給藥過程對(duì)冠脈阻力沒有明顯影響，也沒有心律失常的發(fā)生。 結(jié)論和意義：(1)利用人工合成的肽段，成功制備了三種選擇性同時(shí)激動(dòng)大鼠心肌L-型鈣通道、NCX和鈉泵的多克隆抗肽抗體(LNN抗肽抗體)，它們對(duì)大鼠心肌L-型鈣通

13、道、NCX和鈉泵電流均有不同程度的激動(dòng)作用，而對(duì)大鼠心肌鈉電流，瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)，內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)和豚鼠心肌延遲整流鉀電流(Ik)沒有明顯影響。(2)同時(shí)選擇性地激動(dòng)心肌L-型鈣通道、NCX和鈉泵，是一種提高心肌變力性的新模式。與目前臨床應(yīng)用的正性變力性藥物相比，它的突出特點(diǎn)是在有效增加心肌收縮功能的同時(shí)，又明顯提高了心肌的舒張功能。而且無致心律失常作用。(3)三種LNN抗肽抗體在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)不增加正常離體大鼠冠脈阻力

14、，而哇巴因和bay-k8644卻在增加離體心臟收縮強(qiáng)度的同時(shí)顯著增加了冠脈阻力。(4)LNN抗肽抗體1和LNN抗肽抗體2在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)較高濃度時(shí)會(huì)輕微增加離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的張力，但是其增加幅度明顯小于哇巴因和bay-k8644。LNN抗肽抗體3在所有實(shí)驗(yàn)濃度下都不增加胸主動(dòng)脈環(huán)張力，是三種LNN抗肽抗體中最符合要求的一種。(5)三種LNN抗肽抗體可以不同程度地增加單個(gè)心室肌細(xì)胞鈣瞬變的峰值、上升速率和衰減速率，同時(shí)增加了心肌細(xì)胞縮短的幅

15、度，對(duì)鈣敏感性沒有影響。表明LNN抗肽抗體對(duì)大鼠離體心臟的收縮和舒張功能的增強(qiáng)是通過增加胞漿Ca2+濃度和其變化速率而實(shí)現(xiàn)的。(6)將三條肽段對(duì)L-型鈣通道、NCX和鈉泵的不同作用與其各自對(duì)心肌細(xì)胞鈣瞬變和收縮的影響相比較，可以明確顯示，激動(dòng)L-型鈣通道是增加鈣瞬變幅度與上升速度，近而增強(qiáng)心肌收縮功能的主要因素，而激動(dòng)NCX是加速鈣瞬變衰減速度，近而加速心肌舒張的重要因素。(7)在阻斷L-型鈣通道和NCX的狀態(tài)下使用LNN抗肽抗體激動(dòng)鈉