增強(qiáng)L-型鈣通道、鈉鈣交換體和鈉泵以提高心肌變力性的實驗研究.pdf

1、研究背景：臨床上處理失代償?shù)男牧λソ卟∪?，需要?yīng)用正性變力性藥物改善血流動力學(xué)紊亂，但是目前所有變力性藥物對心肌的舒張功能均無明顯改善作用。面對心排血量不足而又有舒張功能障礙的病人，臨床中迫切需要能同時改善心肌收縮功能與舒張功能的藥物。我們對提高心肌變力性模式的設(shè)想是同時激動心肌L-型鈣通道(L-typecalciumchannel，LCC)，Na/Ca交換體(Na/Caexchanger,NCX)和鈉泵，其中增強(qiáng)心肌LCC作為提高心肌

2、收縮功能的有效途徑，而舒張功能的改善通過激動NCX和鈉泵來實現(xiàn)。鑒于目前在國內(nèi)外還未見同時激動NCX、LCC和鈉泵的的實驗或臨床研究，也未發(fā)現(xiàn)具有這一復(fù)合作用的藥物，為了驗證我們從理論上設(shè)計的提高心肌變力性的新模式，我們嘗試?yán)每闺目贵w實現(xiàn)選擇性地同時激動NCX、LCC和鈉泵的目的。 研究目的：(1)通過對LCC，NCX和鈉泵關(guān)鍵部位氨基酸序列進(jìn)行相似性比對分析，設(shè)計肽段，并以此為抗原，對大鼠進(jìn)行主動免疫，制備出抗肽抗體，然后分

3、離提純大鼠血清中的IgG。利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測各抗體對大鼠心室肌細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白離子電流的影響，篩選出同時激動鈉鈣交換體，L-型鈣通道以及鈉泵的理想抗肽抗體。(2)觀察抗肽抗體對離體大鼠心臟收縮舒張功能和冠脈阻力的影響，及其對離體大鼠胸主動脈環(huán)張力的作用。(3)觀察抗肽抗體對單個心室肌細(xì)胞鈣瞬變及細(xì)胞收縮的影響，以分析抗體對心肌變力性的作用機(jī)制。(4)觀察抗肽抗體對急性衰竭離體灌流心臟心功能的影響。 研究方法：(1)通過對LC

4、C，NCX和鈉泵關(guān)鍵部位氨基酸序列進(jìn)行相似性比對分析，設(shè)計了多條肽段，由美聯(lián)(西安)生物科技有限公司合成。用肽段對大鼠進(jìn)行主動免疫，采用ELISA方法對免疫后大鼠血清抗體滴度進(jìn)行監(jiān)測，應(yīng)用親和層析法提取和純化抗血清中的抗體IgG，并用PAGE膠凝膠電泳對其純度進(jìn)行檢測，用考馬斯亮蘭試劑盒對抗體進(jìn)行定量。(2)分離成年大鼠及豚鼠心室肌細(xì)胞，采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法，觀察抗肽抗體對ICa-L，INCX、INapump以及INa、Ito、Ik

5、1以及Ik的影響。篩選出同時選擇性激動ICa-L，INCX、INapump的抗肽抗體。(3)利用Langendorff心臟灌流裝置觀察抗肽抗體對離體大鼠心臟心功能和冠脈阻力的影響，并觀察在灌流期間有無心律失常的發(fā)生。(4)通過離體大鼠胸主動脈環(huán)實驗，觀察抗肽抗體對大鼠離體胸主動脈環(huán)張力的影響。(5)利用離子影像分析系統(tǒng)，觀察抗肽抗體對單個心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變及細(xì)胞長度的影響。離子影像分析系統(tǒng)記錄激發(fā)光為340nm和380nm的成對系列圖像

6、，從同一對系列計算出340nm/380nm的熒光比值(F340/F380)，并從同一系列圖像計算得到細(xì)胞長度隨時間的變化。(6)利用Langendorff心臟灌流裝置制備大鼠急性心衰模型：對離體大鼠心臟進(jìn)行灌流，先用臺氏液灌流30分鐘，穩(wěn)定后再用含0.1g/L戊巴比妥鈉的臺氏液繼續(xù)灌流，當(dāng)心肌主動收縮力下降至原來的1/2左右時，即可認(rèn)為急性心衰模型制備成功。觀察抗肽抗體對急性衰竭離體大鼠心臟心功能的影響。 研究結(jié)果：(1)用合成

7、的肽段對大鼠進(jìn)行主動免疫，經(jīng)過九周的主動免疫后，各肽段組抗體滴度均顯著增長。應(yīng)用親和層析法提取和純化抗血清中的抗體IgG，PAGE膠凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，純化后的抗體在電泳時，都僅出現(xiàn)一條條帶，分子量為160KDa左右，與IgG標(biāo)準(zhǔn)品相一致，表明純化結(jié)果理想。(2)通過膜片鉗全細(xì)胞記錄法觀察到三種抗肽抗體在10nM，20nM，40nM三個濃度下對ICa-L，INCX、INapump均產(chǎn)生劑量依賴性地激動作用，而對INa、Ito、Ikl以

8、及Ik沒有明顯影響。(3)在10nM，20nM，40nM三個濃度下，三種抗肽抗體均能劑量依賴性地使大鼠離體心臟心功能(LVSP-LVDP，+dp/dtmax，-dp/dtmax)增強(qiáng)，并且在整個給藥過程中沒有心律失常的發(fā)生。同時三種抗肽抗體對大鼠離體灌流心臟的冠脈阻力均沒有明顯影響。(4)在10nM，20nM兩個濃度下，三種抗肽抗體對離體大鼠胸主動脈環(huán)均沒有明顯影響。在40nM濃度時，抗肽抗體1，2能夠輕微增加胸主動脈環(huán)的張力；而抗肽抗

9、體3在該濃度下對胸主動脈環(huán)張力仍沒有顯著作用。(5)三種抗肽抗體(40nM)可以增加單個心室肌細(xì)胞鈣瞬變的峰值和細(xì)胞縮短的程度，同時可以減小TP(timetopeak)，TR50(timeto50％restore)和TR90(timeto90％restore)，提示可以同時增加鈣瞬變上升和下降的速率。同時三種抗肽抗體對心肌的鈣敏感性無顯著影響，表明它們的強(qiáng)心作用與收縮蛋白鈣敏感性的變化無關(guān)。(6)在用KBR7943(10nM)預(yù)處理心肌

10、細(xì)胞后，鈣瞬變的峰值雖然有所下降，但并不明顯。同時TR90延長。這個結(jié)果與鈉鈣交換體在生理情況下主要介導(dǎo)鈣離子外排的理論相一致。再加入抗肽抗體后，鈣瞬變峰值明顯增加，而TR90不再減小，且鈣瞬變峰值增加的幅度與每個抗體對L-型鈣通道激動作用的大小相一致。用尼卡地平(1μm)預(yù)處理心肌細(xì)胞后，鈣瞬變峰值顯著下降，TR90沒有明顯改變，提示經(jīng)L-型鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鈣離子是鈣瞬變峰值的主要決定因素。再加入抗肽抗體后，鈣瞬變峰值有增加的趨勢，

11、但并不顯著，而TR90卻明顯下降，其下降程度與每個抗體對鈉鈣交換激動作用強(qiáng)度相一致。同時用KBR7943和尼卡地平預(yù)處理心肌細(xì)胞后，鈣瞬變的峰值下降，TR90延長，表明心肌細(xì)胞的收縮和舒張活動都受到了抑制，再給抗肽抗體后，不產(chǎn)生改變。這個結(jié)果表明，LNN抗肽抗體對收縮和舒張活動的影響主要是通過激動鈉鈣交換體和L-型鈣通道來實現(xiàn)的，而激動鈉泵對于收縮舒張活動沒有直接的影響。(7)用含0.1g/L戊巴比妥鈉的臺氏液大鼠灌流離體心臟后，LVS

12、P-LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均顯著下降，同時冠脈阻力升高。灌流抗肽抗體均能劑量依賴性地改善大鼠急性衰竭離體心臟的心功能指標(biāo)(LVSP-LVDP，+dp/dtmax，-dp/dtmax)，在整個給藥過程對冠脈阻力沒有明顯影響，也沒有心律失常的發(fā)生。 結(jié)論和意義：(1)利用人工合成的肽段，成功制備了三種選擇性同時激動大鼠心肌L-型鈣通道、NCX和鈉泵的多克隆抗肽抗體(LNN抗肽抗體)，它們對大鼠心肌L-型鈣通

13、道、NCX和鈉泵電流均有不同程度的激動作用，而對大鼠心肌鈉電流，瞬時外向鉀電流(Ito)，內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)和豚鼠心肌延遲整流鉀電流(Ik)沒有明顯影響。(2)同時選擇性地激動心肌L-型鈣通道、NCX和鈉泵，是一種提高心肌變力性的新模式。與目前臨床應(yīng)用的正性變力性藥物相比，它的突出特點是在有效增加心肌收縮功能的同時，又明顯提高了心肌的舒張功能。而且無致心律失常作用。(3)三種LNN抗肽抗體在實驗濃度范圍內(nèi)不增加正常離體大鼠冠脈阻力

14、，而哇巴因和bay-k8644卻在增加離體心臟收縮強(qiáng)度的同時顯著增加了冠脈阻力。(4)LNN抗肽抗體1和LNN抗肽抗體2在實驗范圍內(nèi)較高濃度時會輕微增加離體大鼠胸主動脈環(huán)的張力，但是其增加幅度明顯小于哇巴因和bay-k8644。LNN抗肽抗體3在所有實驗濃度下都不增加胸主動脈環(huán)張力，是三種LNN抗肽抗體中最符合要求的一種。(5)三種LNN抗肽抗體可以不同程度地增加單個心室肌細(xì)胞鈣瞬變的峰值、上升速率和衰減速率，同時增加了心肌細(xì)胞縮短的幅

15、度，對鈣敏感性沒有影響。表明LNN抗肽抗體對大鼠離體心臟的收縮和舒張功能的增強(qiáng)是通過增加胞漿Ca2+濃度和其變化速率而實現(xiàn)的。(6)將三條肽段對L-型鈣通道、NCX和鈉泵的不同作用與其各自對心肌細(xì)胞鈣瞬變和收縮的影響相比較，可以明確顯示，激動L-型鈣通道是增加鈣瞬變幅度與上升速度，近而增強(qiáng)心肌收縮功能的主要因素，而激動NCX是加速鈣瞬變衰減速度，近而加速心肌舒張的重要因素。(7)在阻斷L-型鈣通道和NCX的狀態(tài)下使用LNN抗肽抗體激動鈉