小烏桂顆粒劑對CIA大鼠及其成纖維滑膜細(xì)胞體外增殖的干預(yù)研究.pdf

1、背景:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥為主要表現(xiàn)的，以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征的自身免疫性疾病，其病理主要特點(diǎn)是滑膜細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤、襯里層增厚、血管翳形成，繼而引起軟骨和骨組織的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。臨床表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能下降，病變呈持續(xù)、反復(fù)過程。RA發(fā)病呈全球分布，在我國的發(fā)病率為0.26～0.5％，可發(fā)生于任何年齡，隨著年齡增加發(fā)病率也逐步增加。一般女性多發(fā)，發(fā)病高峰在45～50歲之間。

2、RA病程纏綿、反復(fù)，致殘率高，幾乎所有的RA患者都有不同程度的關(guān)節(jié)功能喪失，由此帶來嚴(yán)重的社會(huì)問題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　 RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中有多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的參與，其主要病理學(xué)特點(diǎn)為滑膜細(xì)胞增生，聚集大量的炎細(xì)胞，如T細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，襯里層增厚，最終形成血管翳，滑膜組織過度增生和血管翳直接侵蝕關(guān)節(jié)軟骨破壞及關(guān)節(jié)軟骨下的骨組織。RA滑膜組織最主要的組成成分是成纖維滑膜細(xì)胞（FLS），其起源于間質(zhì)細(xì)胞，除參與關(guān)節(jié)

3、軟骨降解及骨侵蝕外，還分泌多種前炎癥因子和蛋白，包括IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等，間接參與骨破壞進(jìn)程，是關(guān)節(jié)炎癥和組織破壞的直接效應(yīng)者，在RA的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。
　　 RA患者為Th1及其細(xì)胞因子占優(yōu)勢，促炎因子TNF-α、IL-1及血管新生相關(guān)因子VEGF、MMPs在RA患者血清中明顯升高。Youn等檢測到RA患者血清和關(guān)節(jié)液中TNF-α含量明顯高

4、于骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者及正常人。采用可溶性TNF-α受體融合蛋白或單克隆抗體阻斷TNF-α，可有效減輕RA患者疾病活動(dòng)度，控制骨破壞。在對體外培養(yǎng)的RA-FLS的研究也發(fā)現(xiàn)，阻斷TNF-α可以在一定程度上控制滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)。RA活化的炎癥細(xì)胞在分泌大量炎癥因子的同時(shí)，還分泌大量的MMPs，且RA的血管新生除了與VEGF有關(guān)外，尚與MMPs生物學(xué)活性密切相關(guān)。MMPs是一類活性依賴于金屬鋅離子的蛋白酶，它以酶原形式分泌，經(jīng)激活后參與膠原

5、等細(xì)胞外基質(zhì)的降解而影響血管生成。IL-10是一種天然的免疫抑制劑，它能有效的抑制T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，抑制TNF-α、IL-1的釋放及MMPs的產(chǎn)生，促進(jìn)針對TNF-α、IL-1的受體產(chǎn)生，從而發(fā)揮對軟骨及骨細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 RA屬于祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。痹證的發(fā)生主要是由于正氣不足，感受風(fēng)、寒、濕、熱之邪所致。內(nèi)因是基礎(chǔ)，素體虛弱、正氣不足、腠理不密、衛(wèi)外不固，是引起痹證的內(nèi)在因素，如再感受外邪，使肌肉、關(guān)節(jié)、經(jīng)絡(luò)

6、痹阻而形成痹證。從以上病機(jī)特點(diǎn)看來，治療本病當(dāng)以祛風(fēng)散寒除濕，益氣活血通絡(luò)為大法。小烏桂湯由《千金要方》小續(xù)命湯、《金匱要略》烏頭湯和桂枝芍藥知母湯組成，是全國名老中醫(yī)陳寶田教授研制的，我科臨床應(yīng)用30余年，大量病例證實(shí)有良好療效的經(jīng)驗(yàn)方，其功效為疏風(fēng)散寒、祛濕益氣、養(yǎng)血通絡(luò)。方中以麻黃、桂枝、干姜、防風(fēng)、附子、川烏祛風(fēng)散寒除濕;以當(dāng)歸、川芎、丹皮活血通絡(luò);以黨參、黃芪、當(dāng)歸、白芍扶正益氣養(yǎng)血;石膏、知母用寒涼之品，以防麻黃、桂枝、干姜

7、、川烏等辛溫過度耗傷正氣。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度來看，本方具有消炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫之功能。目前在臨床上用于RA治療，并取得了肯定的療效，但其具體作用機(jī)制尚未清楚。甲氨蝶呤(MTX)是一種細(xì)胞毒藥物，可抑制體液免疫和細(xì)胞免疫，是目前治療RA的一線用藥，其通過多種機(jī)制在RA治療中發(fā)揮作用，如抑制TNF-α、IL-1、IL-12的分泌，降低MMPs活性等，因此本研究選用MTX作為陽性對照藥物。CIA動(dòng)物模型是一種由Ⅱ型膠原誘發(fā)的免疫性炎癥模型，主要表

8、現(xiàn)為多發(fā)性末端關(guān)節(jié)炎，病理變化主要是增生性滑膜炎，繼之關(guān)節(jié)軟骨破壞直至骨的破壞，單核細(xì)胞浸入并持續(xù)存在于滑膜中，且動(dòng)物體內(nèi)存在針對自身Ⅱ型膠原的高滴度IgG抗體，說明其免疫功能變化兼有體液免疫及細(xì)胞免疫，這些變化均與人類RA相似，目前被公認(rèn)為研究RA發(fā)病機(jī)制的經(jīng)典動(dòng)物模型，也是研究RA治療藥物的理想動(dòng)物模型之一。研究小烏桂顆粒劑對CIA大鼠及其成纖維滑膜細(xì)胞（CIA-FLS）體外增殖的影響有助于進(jìn)一步探討小烏桂顆粒劑治療RA的可能機(jī)制。

9、
　　 目的:
　　 1.評價(jià)小烏桂顆粒劑對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的治療效果及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響。
　　 2.探討小烏桂顆粒劑含藥血清對CIA-FLS體外增殖及相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響。
　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 SPF級雌性SD大鼠82只（70只大鼠CIA造模后進(jìn)行模型評價(jià)、小烏桂顆粒劑體內(nèi)干預(yù)及CIA-FLS獲取;12只大鼠小烏桂顆粒劑灌胃后用于含藥血清獲?。w重200g±

10、20g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供(許可證號:NO.440210192)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)藥物
　　 小烏桂顆粒劑:小烏桂顆粒劑175g/劑（廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)），主要組成:麻黃、桂枝、當(dāng)歸、黨參、石膏、干姜、川芎、白芍、黃芪、川烏、知母、防風(fēng)、附子、丹皮、黃芩、炙甘草。甲氨蝶呤片（上海信誼藥廠），甲氨蝶呤粉劑（sigma公司）。
　　 3.研究方法
　　 3.1小烏桂顆粒劑對CIA大鼠關(guān)節(jié)

11、炎的治療效果及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響。采用雞Ⅱ型膠原建立CIA大鼠模型，運(yùn)用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)評分法及病理切片炎癥程度評分系統(tǒng)對其評價(jià)。將造模成功的CIA大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，并于第22d開始，用蒸餾水配置的高中低劑量小烏桂顆粒劑(2ml/只/次/d)及MTX(0.9mg/kg/w)、蒸餾水空白（2ml/只/次/d）對各組CIA大鼠進(jìn)行灌胃，連續(xù)21d。各組藥物干預(yù)CIA大鼠后，每隔7d，用AI評分

12、方法記錄關(guān)節(jié)炎病變的發(fā)生及嚴(yán)重程度;干預(yù)21d(即造模42d)后，用病理切片的炎癥程度的評分系統(tǒng)對各組大鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行病理評分。ELISA檢測CIA大鼠干預(yù)前及干預(yù)的第21d外周血血清中TNF-α和IL-10的水平。
　　 3.2小烏桂顆粒劑含藥血清對CIA-FLS體外增殖及相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響。組織塊培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)CIA-FLS，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫組化法對細(xì)胞波形蛋白(vimentin)進(jìn)行鑒定并進(jìn)行細(xì)胞純度計(jì)

13、算。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、MTX組(0.3μmol/L)及高中低劑量小烏桂顆粒劑含藥血清組5組，分別干預(yù)CIA-FLS24h、48h、72h，MTT法檢測其增殖情況，ELISA檢測培養(yǎng)上清中TNF-α和MMP-1的水平。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示，正態(tài)分布計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用bonferroni檢驗(yàn);非正態(tài)分布計(jì)量資料采用多重非參數(shù)檢驗(yàn)

14、，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.小烏桂顆粒劑對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的治療效果及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響CIA造模后第21d，大鼠雙側(cè)足爪關(guān)節(jié)包括踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹，76％(44/58)大鼠AI評分≥4，造模成功大鼠的整體AI評分X=6.68±0.77。高中低劑量的小烏桂顆粒劑組和MTX組干預(yù)CIA大鼠7d、14d、21d，其AI評分均明顯下降，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高中低劑量的小烏桂顆粒劑組和M

15、TX組干預(yù)CIA大鼠21d，其病理評分下降，外周血血清TNF-α的水平降低，IL-10的水平升高，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.小烏桂顆粒劑含藥血清對CIA-FLS體外增殖及相關(guān)細(xì)胞因子分泌的影響。高中劑量小烏桂顆粒劑含藥血清組和MTX組干預(yù)CIA-FLS24h、48h、72h均可明顯抑制其增殖，培養(yǎng)上清中TNF-α、MMP-1的水平明顯降低，與空白對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;低劑量小烏桂顆粒劑含藥血清組干預(yù)CIA-FLS

16、48h、72h可明顯抑制CIA-FLS增殖，培養(yǎng)上清中TNF-α的水平明顯降低，其干預(yù)CIA-FLS24h、48h、72h培養(yǎng)上清中MMP-1的水平均明顯降低，與空白對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.小烏桂顆粒劑有效降低CIA大鼠的AI評分及病理學(xué)評分，其對CIA大鼠有治療作用。
　　 2.小烏桂顆粒劑有效降低CIA大鼠外周血血清中TNF-α的水平、升高IL-10的水平，說明其可以糾正CIA大鼠