快速反向點雜交HPV基因分型——方法建立及其與宮頸病變關(guān)系的研究.pdf

1、宮頸癌是僅次于乳腺癌導(dǎo)致婦女死亡的第二大惡性腫瘤，我國每年新發(fā)病例13.15萬，每年約5萬人死于宮頸癌。研究表明人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是引起宮頸癌的直接病因，大多HPV感染是一過性的，只有高危型HPV的持續(xù)感染或反復(fù)感染才能導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。 人乳頭瘤病毒是乳多空病毒科A屬成員，為雙鏈閉環(huán)DNA病毒，基因組長度7200-8000bp，可分為3個區(qū)段：早期區(qū)、晚期區(qū)及長控制區(qū)。早期區(qū)與晚期區(qū)

2、有八個主要開放讀碼框架，與DNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細胞轉(zhuǎn)化有關(guān)。 目前確定的HPV型別約有120余種，依其感染的上皮所在部位分為皮膚型HPV和生殖道型HPV，大約40種型別涉及生殖道感染，依據(jù)不同型HPV感染導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的危險性高低，HPV分為低危型和高危型。HPV檢測及基因分型對宮頸癌的預(yù)防、診斷以及治療有重要的指導(dǎo)意義。本文建立了一種快速反向點雜交方法對HPV基因分型并對珠三角地區(qū)21型常見HPV基因型分布以及HPV感染與不

3、同宮頸病變的關(guān)系進行了研究。 目的 本研究設(shè)計合成21型HPV特異型別探針(包括15種高危型和5種低危型及cp8304型)，應(yīng)用DNA雜交儀建立一種快速反向點雜交(ReverseDotBlot，RDB)HPV基因分型方法，并對該系統(tǒng)進行評價。同時利用該方法檢測珠三角地區(qū)臨床標(biāo)本，分析珠三角地區(qū)21型常見HPV基因型分布情況，探討不同基因型與宮頸病變的臨床關(guān)系。 方法 收集廣東省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科門診病例355

4、例，按薄層液基細胞學(xué)檢測結(jié)果(BethesdaSystem1999分級系統(tǒng))將病例分為五組：NILM、ASC-H、ASCUS、LSIL、HSIL。選取通用引物MY09/11和內(nèi)參Globin引物GH20/PC04，引物用生物素標(biāo)記；根據(jù)21型序列比對結(jié)果設(shè)計HPV21種亞型的特異性探針，其中包括15種常見高危型和5種低危型及cp8304型，同時設(shè)計了內(nèi)參基因Globin探針，探針均用氨基標(biāo)記；對臨床標(biāo)本進行PCR擴增和快速反向點雜交分型

5、檢測。經(jīng)過對臨床標(biāo)本的篩選，制備HPV不同型別陽性標(biāo)準(zhǔn)模板。應(yīng)用DNA雜交儀進行雜交，并分別對探針濃度、雜交溫度、雜交時間三個條件進行優(yōu)化，建立快速反向點雜交HPV基因分型方法；同時利用FDA認(rèn)證的雜交捕獲Ⅱ代方法對臨床標(biāo)本進行HPV檢測，比較兩種方法檢測結(jié)果，對快速反向點雜交分型方法進行系統(tǒng)評價。此外，利用快速反向點雜交對珠三角地區(qū)臨床標(biāo)本進行21常見HPV基因分型，了解珠三角地區(qū)HPV基因型分布情況。 結(jié)果 一、快速

6、反向點雜交HPV基因分型方法的建立及評價 1.成功建立快速反向點雜交對HPV基因分型 提取標(biāo)本DNA質(zhì)量完好，21型HPV基因型陽性模板重組質(zhì)粒經(jīng)測序證實。系統(tǒng)最佳條件為：探針濃度為15pmol/μl，雜交溫度為45℃，雜交時間為10分鐘。21型臨床標(biāo)本經(jīng)快速反向點雜交檢測分型，藍色斑點清晰可見，各型別間無非特異顯色；快速反向點雜交檢測HPV基因型最低限度為102-104copies。 2.基因分型結(jié)果

7、通過快速反向點雜交進行基因分型，355例宮頸刷標(biāo)本中共檢測出陽性標(biāo)本211例(59.4％)，其中單型感染有150(71.1％)例，混合感染61例(28.9％)。共檢測出15種常見高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)以及3種低危型(6、11、42)。另有兩例PCR擴增電泳結(jié)果呈陽性，分型無結(jié)果，經(jīng)克隆測序鑒定后分別為73型和54型。 3.雜交捕獲Ⅱ代(hybridcap

8、ture，HCⅡ)方法和快速反向點雜交進行HPV分型的結(jié)果比較 355例標(biāo)本中，雜交捕獲Ⅱ代方法和快速反向點雜交分別檢測出222例和211例陽性標(biāo)本，以HCⅡ為標(biāo)準(zhǔn)，快速反向點雜交的靈敏度為92.8％(206/222)，特異度為96.2％(128/133)。兩種方法比較χ2值0.72，取得了較好的一致性。 二、珠三角地區(qū)HPV型別分布以及各基因型與不同宮頸病變關(guān)系 1.珠三角地區(qū)21型常見HPV基因型分布

9、 利用快速反向點雜交分型方法對1085例標(biāo)本進行HPV基因分型，共檢測出437例HPV感染病例，總陽性率為40.3％，其中單型感染有319例(73.0％)；混合感染有118例(27.0％)，共檢出23種HPV型別，其中包括16種高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73)和6種低危型(6、11、42、43、44、54)以及cp8304型。在23種型別中，感染率最高的為16型(2

10、4.5％)，其次為52型(16.2％)、58型(16.0％)、56型(7.3％)、31型(6.9％)等。 2.生殖道HPV感染基因亞型分布與不同宮頸病變的關(guān)系 355例病例中不同宮頸病變HPV感染率有所不同，χ2為50.56，P＜0.05顯示不同的宮頸疾病中HPV感染率存在差異。NILM、ASC-H、ASCUS、LSIL、HSIL組中利用快速反向點雜交和HCⅡ方法檢出HPV感染率分別為43.3％/46.4％、50.0％/

11、50％、74.1％/79.5％、80.8％/82.2％、91.7％/95.8％；隨著宮頸疾病程度的加重，HPV的感染率也隨之增高。宮頸病變程度不同HPV感染的基因型也存在差異。各疾病組型別分布情況存在不同：ASCUS中前四位感染型別為16、52、58、56。而在LSIL中前四位感染型別為58、16、52、56。在HSIL組中前四位感染型別為16、58、33、52，感染率分別為54.2％、12.5％、8.3％、8.3％，HSIL組中16型

12、感染率超過了50％。 結(jié)論 1.本研究成功建立了一種快速簡便的反向點雜交HPV基因分型方法，并與雜交捕獲Ⅱ代基因分型方法進行比較，兩法取得了較好的一致性。 2.珠三角地區(qū)21型常見HPV基因型分布主要是HPV16、HPV52、HPV58、HPV56和HPV31；各型的感染率分別是24.5％、16.2％、16.0％、7.3％、6.9％。 3.不同宮頸病變中，HPV感染率與型別分布均不同。良性宮頸病變ASC-