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文檔簡介
1、目的:作為異源性表達(dá)載體,非洲爪蟾卵母細(xì)胞用于各種蛋白的表達(dá),包括受體、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體等,為研究所表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及藥理學(xué)特性提供了重要的手段。本實(shí)驗(yàn)旨在建立爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)體系,并進(jìn)一步研究所要表達(dá)的NMDA受體蛋白的結(jié)構(gòu)及功能。 方法:在去除濾泡膜的非洲爪蟾卵母細(xì)胞上,建立雙電極電壓鉗記錄技術(shù),并使用該技術(shù)觀察爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性遞質(zhì)門控性和電壓門控性離子通道電流。將所研究的NMDA受體亞單位NR-1A、NR-2A
2、、NR-2B的cDNA分別體外轉(zhuǎn)錄為cRNA后,將其射到爪蟾卵母細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。采用雙電極電壓鉗技術(shù)證實(shí)NR-1A/NR-2A和NR-1A/NR-2B受體的功能性表達(dá)。并對(duì)所表達(dá)的NMDA受體不同亞型的藥理學(xué)特性進(jìn)行了研究。 結(jié)果:灌流液中分別加入NMDA受體、γ-氨基丁酸和煙堿受體激動(dòng)劑,均未能在未注射外源性cRNA的爪蟾卵母細(xì)胞上誘發(fā)出電流。去極化刺激僅可誘發(fā)出一外向電流。將NR-1A/NR-2A、NR-1A/NR-2B分別注
3、入爪蟾卵母細(xì)胞后,灌流液中加入NMDA受體激動(dòng)劑L-谷氨酸和甘氨酸可在卵母細(xì)胞上誘發(fā)出內(nèi)向電流,其中注射過2B亞單位激活的電流可被2B選擇性拮抗劑氟哌啶醇阻斷,而對(duì)注射過2A亞單位激活的電流作用不明顯。胍丁胺和苯環(huán)壬酯手性化合物能可逆性阻斷NMDA受體(NR-1A/NR-2A、NR-1A/NR-2B)電流,其中胍丁胺的阻斷作用除具有電壓依賴性外還有濃度依賴性。 結(jié)論:成功建立了爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)體系,并使用雙電極電壓鉗記錄技術(shù),對(duì)
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