阿爾茨海默病小分子致病多肽在真核Pichia pastoris酵母和原核BL21（DE3）體系中的表達(dá)研究.pdf

1、　　為了能對(duì)β-淀粉樣蛋白(Aβ)在阿爾茨海默病(AD)發(fā)病和免疫治療中的作用及機(jī)理的進(jìn)一步研究提供必要的基礎(chǔ)，本課題設(shè)計(jì)采用真核畢赤巴斯德(Pp)酵母以及原核大腸桿菌BL21(DE3)兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行Aβ小分子多肽的表達(dá)，探索研究適于目的小分子多肽表達(dá)的系統(tǒng)，并使之高效表達(dá)和制備。由此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)小分子多肽在兩種體系中的表達(dá)分別進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)研究和探討。課題的實(shí)施分兩部分，第一部分是在真核系統(tǒng)中表達(dá)Aβ小分子多肽，首先分別構(gòu)建表達(dá)重

2、組質(zhì)粒載體pA0815-αAβ42(單拷貝及多拷貝)和pPIC9K-aAβ42，然后將其線性化電擊轉(zhuǎn)染整合入Pp基因組中，鑒定陽(yáng)性菌株，篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，但經(jīng)過(guò)SDS-PAGE、ELISA、DotBlot、WesternBlotting一系列檢測(cè)未獲得目的蛋白的表達(dá)。第二部分是在原核系統(tǒng)中表達(dá)Aβ小分子多肽，首先構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒載體pTWIN1/Alb-Intein-Aβ42，然后將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3

3、)中，篩選出高效表達(dá)的菌株，融合蛋白表達(dá)量為全菌蛋白的60％，對(duì)其培養(yǎng)條件及融合蛋白的變性、復(fù)性、裂解條件進(jìn)行優(yōu)化，然后進(jìn)行純化回收，回收效率可達(dá)50％；純化產(chǎn)物經(jīng)分子量、等電點(diǎn)、免疫原性等檢測(cè)證實(shí)為Aβ42，1L菌液約可獲得33mg純化的Aβ42。結(jié)論：本論文課題研究采用兩種系統(tǒng)(真核細(xì)胞畢赤巴斯德酵母，原核細(xì)胞大腸桿菌BL21(DE3))表達(dá)具有疏水特性的Aβ小分子多肽，經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，結(jié)果提示該多肽可能不適合在真核細(xì)胞畢赤巴斯德酵