阿爾茨海默病小分子致病多肽在真核Pichia pastoris酵母和原核BL21（DE3）體系中的表達研究.pdf

1、　　為了能對β-淀粉樣蛋白(Aβ)在阿爾茨海默病(AD)發(fā)病和免疫治療中的作用及機理的進一步研究提供必要的基礎(chǔ)，本課題設(shè)計采用真核畢赤巴斯德(Pp)酵母以及原核大腸桿菌BL21(DE3)兩個表達系統(tǒng)進行Aβ小分子多肽的表達，探索研究適于目的小分子多肽表達的系統(tǒng)，并使之高效表達和制備。由此，本實驗對小分子多肽在兩種體系中的表達分別進行了一系列的實驗研究和探討。課題的實施分兩部分，第一部分是在真核系統(tǒng)中表達Aβ小分子多肽，首先分別構(gòu)建表達重

2、組質(zhì)粒載體pA0815-αAβ42(單拷貝及多拷貝)和pPIC9K-aAβ42，然后將其線性化電擊轉(zhuǎn)染整合入Pp基因組中，鑒定陽性菌株，篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)誘導(dǎo)表達目的蛋白，但經(jīng)過SDS-PAGE、ELISA、DotBlot、WesternBlotting一系列檢測未獲得目的蛋白的表達。第二部分是在原核系統(tǒng)中表達Aβ小分子多肽，首先構(gòu)建表達重組質(zhì)粒載體pTWIN1/Alb-Intein-Aβ42，然后將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3

3、)中，篩選出高效表達的菌株，融合蛋白表達量為全菌蛋白的60％，對其培養(yǎng)條件及融合蛋白的變性、復(fù)性、裂解條件進行優(yōu)化，然后進行純化回收，回收效率可達50％；純化產(chǎn)物經(jīng)分子量、等電點、免疫原性等檢測證實為Aβ42，1L菌液約可獲得33mg純化的Aβ42。結(jié)論：本論文課題研究采用兩種系統(tǒng)(真核細胞畢赤巴斯德酵母，原核細胞大腸桿菌BL21(DE3))表達具有疏水特性的Aβ小分子多肽，經(jīng)過一系列實驗，結(jié)果提示該多肽可能不適合在真核細胞畢赤巴斯德酵