鹽酸小檗堿對草魚補體C3作用機理及藥代動力學研究.pdf

1、近年來，免疫學在水產(chǎn)上的研究已成為研究水產(chǎn)動物病害的熱點之一，免疫機制的研究為合理有效地防治各類動物疾病提供依據(jù)。傳統(tǒng)的預(yù)防與治療水產(chǎn)動物疾病以使用抗生素為主，但不良反應(yīng)多，副作用顯著。然而人們發(fā)現(xiàn)越來越多的中藥不僅具有良好的抗菌和提供免疫力的作用而且副作用少。黃連具有清熱解毒及殺菌的功效，其主要化學成分是生物堿，例如，小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿、藥根堿，其中小檗堿含量約6％-10%。已有文獻報道黃連可以提高魚類的免疫力，因此，我

2、們對黃連生物堿進行提取與分離并研究小檗堿對草魚補體C3作用的機理研究，闡明黃連提高水產(chǎn)類動物免疫力的物質(zhì)基礎(chǔ)，為黃連在水產(chǎn)上的應(yīng)用與開發(fā)提供理論依據(jù)
　　本論文的主要內(nèi)容與結(jié)果
　　1、黃連中生物堿的提取分離與鑒定
　　運用高速逆流色譜法（HSCCC），以氯仿-甲醇-0.2mol/L鹽酸作為溶劑體系從黃連的生物堿粗提物中進一步分離制備了4種生物堿類化合物，通過1H NMR和13C NMR核磁波譜技術(shù)并結(jié)合相關(guān)文獻報道確

3、定4個化合物分別為小檗堿、巴馬汀、表小檗堿及黃連堿。與傳統(tǒng)的分離方法相比，高速逆流色譜法（HSCCC）具有分離周期短，溶劑用量少，操作簡便快捷，在中藥成分分離上具有獨特的優(yōu)勢。
　　2、鹽酸小檗堿對感染嗜水氣單胞菌草魚存活率的影響
　　實驗取體重均勻且健康的草魚150條，隨機分為5組：對照組（NC)、模型組（M）、鹽酸小檗堿0.06%組（BBR-L）、鹽酸小檗堿0.12%組（BBR-M）、鹽酸小檗堿0.24%組(BBR-H)

4、。實驗組投喂相應(yīng)的濃度的鹽酸小檗堿飼料，對照組與模型組投喂基礎(chǔ)飼料，每天投喂飼料10g/尾，連續(xù)投喂14天后，模型組和實驗組腹腔注射0.2mL嗜水氣單胞菌(108cfu/mL)，對照組注射等量的無菌生理鹽水。記錄草魚死亡情況，實驗重復(fù)三次，取三次實驗的平均值。結(jié)果顯示給藥組草魚的存活率分別為50%、70%、73.3%，模型組(M)存活率僅為10%，對照組沒有死亡情況。經(jīng)統(tǒng)計分析，各個藥物濃度試驗組草魚存活率均顯著提高(P<0.01)。表

5、明鹽酸小檗堿能提高草魚的免疫力，且與劑量相關(guān)。
　　3、鹽酸小檗堿對草魚非特異性免疫指標的影響
　　本實驗取80條體型大小相似的草魚隨機分為4組，每組20條，分別為對照組（NC)、0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組，給藥組投喂相應(yīng)的濃度的鹽酸小檗堿飼料，對照組投喂基礎(chǔ)飼料。各組每天投喂飼料10g/尾，觀察草魚進食和活動情況，在第7天和第14天尾靜脈取血，測定草魚免疫指標補體C3含量、溶菌酶活性、呼吸爆發(fā)活性。

6、實驗數(shù)據(jù)使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析及LSD對樣品進行多重比較。實驗結(jié)果表明：在第七天，0.12%和0.24%鹽酸小檗堿給藥組血清中補體C3含量與對照組相比顯著性提高（P<0.05），溶菌酶活性和呼吸爆發(fā)活性均有所上升，但未見顯著性差異（P>0.05）；第14天，各濃度給藥組的草魚補體C3含量均表現(xiàn)顯著性提高（P<0.05）；溶菌酶活性升高，但均未達顯著差異（P>0.05）；0.12

7、%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組呼吸爆發(fā)活性升高且具有顯著性差異（P<0.05），0.06%鹽酸小檗堿給藥組活性雖有升高，但未見顯著差異（P>0.05）。表明鹽酸小檗堿能提高草魚的非特異性免疫功能。
　　4、鹽酸小檗堿對草魚補體C3 mRNA表達的影響
　　隨機將80條健康且體型大小相似的草魚分為4組，分別為對照組、0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組。試驗組投喂相應(yīng)的濃度的鹽酸小檗堿飼料，對照組投喂基礎(chǔ)飼料，每

8、天投喂飼料10g/尾。觀察草魚進食情況和活動情況，喂養(yǎng)14天后，麻醉后殺死，取其肝臟，提取草魚肝臟補體C3 mRNA，利用Primer5引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，采用10μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA，用核酸定量儀測定RNA濃度。實驗數(shù)據(jù)使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析及LSD對樣品進行多重比較。PCR結(jié)果顯示，0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組補體C3 mRNA表達均上調(diào)，

9、與對照組比較，各給藥組補體C3 mRNA表達上調(diào)比例分別為20.57%、27.35%、26.49%，具有顯著性差異（P<0.05），上調(diào)的趨勢與血清中補體C3的結(jié)果類似。研究表明鹽酸小檗堿能上調(diào)草魚補體C3 mRNA的表達。
　　5、補體消耗試驗
　　草魚空白血清中加入鹽酸小檗堿配制成2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L，80mg/L的鹽酸小檗堿血清溶液，進行補體消耗試驗。實驗結(jié)果表

10、明：鹽酸小檗堿在血清中濃度達到5mg/L，可以激活補體C3，但未達顯著水平。當鹽酸小檗堿濃度達到10mg/L，激活作用達到顯著水平（P＜0.05）。表明高濃度的鹽酸小檗堿通過與補體C3的結(jié)合改變補體C3的構(gòu)型從而激活補體C3，激活程度呈劑量依賴關(guān)系。
　　6、草魚體內(nèi)鹽酸小檗堿藥代動力學研究
　　取健康草魚72條（500±10g），按48mg/kg魚體重灌服鹽酸小檗堿（5mg/mL），分別在0.5h、1h、1.5h、2h、3