協(xié)同信號(hào)分子B7-H3對(duì)肺炎球菌腦膜炎小鼠趨化因子KC、MIP-2及TLR2蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　細(xì)菌性腦膜炎是兒童時(shí)期較嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，近年來，盡管以抗生素為主導(dǎo)的治療手段使細(xì)菌性腦膜炎預(yù)后已大為改觀，但是該病目前仍有較高的死亡率和致殘率，因此進(jìn)一步研究細(xì)菌性腦膜炎的免疫病理機(jī)制，尋找新的干預(yù)手段意義重大。細(xì)菌性腦膜炎最顯著的病理特征之一是由于外周血大量的炎癥細(xì)胞在趨化因子的作用下，穿越血腦屏障，向腦內(nèi)遷移和聚集。因此，炎性趨化因子在介導(dǎo)細(xì)菌性腦膜炎的免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮舉足輕重的作用。角蛋白趨化因子

2、（Keratinocyte chemoattractant，KC）和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2（Macrophage-inflammatory protein2， MIP-2）是CXC類趨化因子中的重要成員，在機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。協(xié)同信號(hào)分子是介導(dǎo)抗感染免疫應(yīng)答過程的重要成分，B7同源性3（B7 Homology3， B7-H3）是 B7家族的新成員，其在抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)控作用。本研究在我們前期發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性腦膜炎患

3、兒體內(nèi)可溶性 B7-H3分子異常高表達(dá)的基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察B7-H3對(duì)細(xì)菌性腦膜炎動(dòng)物模型中趨化因子KC、MIP-2及TLR2（Toll-like receptor2）蛋白表達(dá)的影響，探討B(tài)7-H3在細(xì)菌性腦膜炎炎癥趨化作用的影響，了解其在細(xì)菌性腦膜炎病情進(jìn)展中的作用，以期為細(xì)菌性腦膜炎的免疫干預(yù)提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、體內(nèi)試驗(yàn)，研究B7-H3對(duì)肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠神經(jīng)行為學(xué)改變、體質(zhì)量的變

4、化和腦組織勻漿中趨化因子KC、MIP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量及TLR2蛋白的表達(dá)的影響。取月齡為1.5-2月的健康雄性BALB/C小鼠48只，隨機(jī)分為4組：生理鹽水對(duì)照組（CON組）、B7-H3組（B7-H3組）、肺炎鏈球菌組（SP組）、肺炎鏈球菌+B7-H3蛋白組（SP+B7-H3組）；每組12只小鼠。腹腔注射誘導(dǎo)麻醉后，通過側(cè)腦室定位注入10μl無菌生理鹽水+5μl肺炎鏈球菌混懸液來建立小鼠細(xì)菌性腦膜炎模型；CON組注射15μl無菌

5、生理鹽水，B7-H3組注入10μlB7-H3蛋白+5μl無菌生理鹽水，SP組注入10μl無菌生理鹽水+5μl肺炎鏈球菌混懸液，SP+B7-H3組注入10μlB7-H3蛋白+5μl肺炎鏈球菌混懸液。分別于側(cè)腦室注射后6h、24h對(duì)各組小鼠進(jìn)行：1）神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、2）記錄體質(zhì)量的變化、3）HE染色方法觀察腦組織炎癥狀況、4）Real-time PCR方法檢測(cè)腦組織中趨化因子KC、MIP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量、5）免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大

6、腦皮層中TLR2蛋白的表達(dá)。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)，研究 B7-H3對(duì)肺炎鏈球菌感染條件下小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中趨化因子KC、MIP-2表達(dá)的影響。選用生后1-3天的BALB/C新生小鼠，無菌條件下取腦組織，經(jīng)分離、培養(yǎng)、純化后獲得原代小膠質(zhì)細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×105/孔。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組（CON組）、肺炎鏈球菌感染組（SP組）、肺炎鏈球菌+B7-H3蛋白組（SP+B7-H3組）,三組細(xì)胞體系中均加入等量的頭孢曲

7、松（濃度為100μg?ml-1）以抑制細(xì)菌的過度繁殖。分別在刺激后5h、24h、48h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA方法檢測(cè)上清液中趨化因子KC、MIP-2的濃度變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　一、體內(nèi)試驗(yàn)
　　1、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：各組小鼠側(cè)腦室注射后6h、24h后進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分， B7-H3組與 CON組相比6h（5.0±0）vs（5.0±0）、24h（5.0±0）vs（5.0±0），差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05

8、）；SP組評(píng)分相對(duì)CON組明顯降低6h（3.67±0.52）vs（5.0±0）、24h（2.0±0.63）vs（5.0±0），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而SP+B7-H3組相比SP組評(píng)分更低6h（2.83±0.75）vs（3.67±0.52）、24h（1.17±0.41） vs（2.0±0.63），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2、體質(zhì)量變化比較：分別記錄各組小鼠側(cè)腦室注射前和注射后6h、24h體質(zhì)量的變化，

9、B7-H3組與CON組相比6h（0.06±0.27）vs（0.11±0.59）、24h（0.92±0.8） vs（0.04±0.93），差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；SP組體質(zhì)量相對(duì) CON組降低明顯6h（0.99±0.21）vs（0.11±0.59）、24h（2.3±0.39）vs（0.04±0.93），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而SP+B7-H3組相比SP組體質(zhì)量明顯下降6h（1.51±0.44） vs（0.99±0.

10、21）、24h（2.68±0.18）vs（2.3±0.39），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3、腦組織HE染色：在6h時(shí)，SP組相對(duì)于CON組軟腦膜血管充血明顯，蛛網(wǎng)膜下腔顯著擴(kuò)張，腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔有炎癥細(xì)胞浸潤；SP+B7-H3組相對(duì)于 SP組軟腦膜血管充血更加顯著，蛛網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整性破壞，蛛網(wǎng)膜下腔開放，腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔大量炎癥細(xì)胞浸潤。
　　24h時(shí)，SP組相對(duì)于CON組軟腦膜血管充血較前明顯，蛛網(wǎng)膜下腔顯著

11、擴(kuò)張，腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔有炎癥細(xì)胞浸潤，SP+B7-H3組相對(duì)于 SP組軟腦膜血管充血更加顯著，蛛網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整性極度破壞，蛛網(wǎng)膜下腔開放，腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔炎癥細(xì)胞浸潤加劇并伴有炎癥細(xì)胞向蛛網(wǎng)膜下腔外遷移。
　　4、腦組織勻漿Real-time PCR檢測(cè)KC、MIP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量：在細(xì)菌注射6h后，SP組KC mRNA的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)于CON組明顯升高（13.48±1.056） vs（1±0.078），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

12、<0.05）； SP+B7-H3組KC mRNA的相對(duì)表達(dá)量與SP組相比明顯升高（16.92±7.461）vs（13.48±1.056），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；24h時(shí)SP組KC mRNA相對(duì)表達(dá)量較CON組明顯升高（16.19±1.766） vs（1±0.236），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），SP+B7-H3組KC mRNA的相對(duì)表達(dá)量與SP組相比明顯升高（80.33±47.595）vs（16.19±1.766）

13、，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在細(xì)菌注射后6h，SP組MIP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量較CON組升高（1.21±0.932）vs（1.01±0.008），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），SP+B7-H3組MIP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與SP組相比有升高（1.24±0.804）vs（1.21±0.932），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；24h時(shí)SP組MIP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量較CON組明顯升高（12.88±7.792）

14、vs（1.00±0.091），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），SP+B7-H3組 MIP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與 SP組相比明顯升高（38.76±6.061）vs（12.88±7.792），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）
　　5、腦組織免疫組化結(jié)果分析：三組腦膜炎小鼠腦組織胞膜和胞漿上均可見TLR2棕黃色陽性顆粒，6h、24hCON組TLR2有少量表達(dá)；SP組6h時(shí)表達(dá)開始上調(diào)（32.67±3.93）vs（1.00±0

15、.63），24h時(shí)表達(dá)明顯增多（59.83±12.12）vs（2.16±0.75），各時(shí)間點(diǎn)與CON組比較明顯增高（P<0.01）；SP+B7-H3干預(yù)組TLR2的表達(dá)較SP組進(jìn)一步增高6h（50.5±8.73）vs（32.67±3.93）、24h（86.33±3.2）vs（59.83±12.12），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　二、體外實(shí)驗(yàn)
　　1、SP組在細(xì)菌刺激后5h、24h、48h時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中

16、趨化因子 KC的濃度明顯升高于CON組（219.19±139.87）vs（18.44±16.32），（P<0.05）；（2883.38±1957.20）vs（44.96±25.73），（P<0.05）；（4883.44±1062.75）vs（169.64±86.95） pg?ml-1，（P<0.05）;SP+B7-H3組在刺激后5h、24h、48h與SP組相比，KC的濃度均進(jìn)一步顯著上升（1460.16±553.44）vs（219.19

17、±139.87），(P<0.05)；（6993.51±4869.28）vs（2883.38±1957.20），(P<0.05)；（10394.47±6012.32）vs（4883.44±1062.75） pg?ml-1，(P<0.05)。
　　2、SP組在刺激后5h、24h、48h時(shí)趨化因子MIP-2的表達(dá)明顯升高于CON組（324.60±2.29）vs（279.87±10.15），(P<0.05)；（340.00±23.38）v

18、s（287.78±9.89），(P<0.05)；（907.81±72.65）vs（288.66±13.50）pg?ml-1，(P<0.05);SP+B7-H3組在刺激后5h、24h、48h與SP組相比，MIP-2的表達(dá)均顯著上升（351.91±27.15）vs（324.60±2.29），(P<0.05)；（398.88±6.76）vs（340.00±23.38），(P<0.05)；（1483.75±211.50）vs（907.81±72

19、.65）pg?ml-1，(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、本實(shí)驗(yàn)經(jīng)側(cè)腦室注射肺炎鏈球菌混懸液，成功建立了小鼠肺炎鏈球菌性腦膜炎模型。
　　2、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，趨化因子KC、MIP-2及TLR2蛋白在肺炎鏈球菌腦膜模型中表達(dá)量升高，趨化因子及 TLR2參與了腦膜炎病理損傷和免疫炎癥反應(yīng)過程。
　　3、協(xié)同信號(hào)分子 B7-H3加劇了細(xì)菌性腦膜炎病情的進(jìn)展，促進(jìn)腦組織免疫炎癥反應(yīng)，使趨化因子KC、MIP-2及