結(jié)核性腦膜炎腦脊液細(xì)胞學(xué)及易感基因(TLR2 T597C)的研究.pdf

1、目的
　　 結(jié)核性腦膜炎(Tuberculousmeningitis，TBM)是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)感染后最嚴(yán)重的形式，它導(dǎo)致20-25％的感染者死亡，并致使生存患者遺留嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1]。高死亡率、高致殘率的原因部分與診斷延誤并由此造成治療延誤有關(guān)，因此提高TBM的早期診斷水平成為目前TBM診療中急需解決的問題之一。而在對(duì)TBM病人的統(tǒng)計(jì)分析中發(fā)現(xiàn)，全世界約1/3人

2、口感染Mtb，10％的感染者出現(xiàn)結(jié)核病的臨床癥狀，僅1％發(fā)展為TBM[1,2]，這可能受宿主基因、環(huán)境及病原菌因素的影響。
　　 TBM的診斷困難主要?dú)w結(jié)于1.TBM臨床表現(xiàn)不典型;2.目前缺少快速敏感的診斷方法。而延誤診斷及治療是造成TBM患者死亡率高的主要原因。TBM的發(fā)病率在生活水平較低、生活環(huán)境較差的國家和地區(qū)明顯較高，而抗酸染色作為診斷TBM的金標(biāo)準(zhǔn)之一，耗時(shí)較短，所需設(shè)備及試劑廉價(jià)，在幾種診斷金標(biāo)準(zhǔn)中，不失為一種理想

3、的確診方法。但是不同實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的陽性率差別較大并且受藥物影響較明顯，經(jīng)過5-15天的藥物治療后，陽性率可從52％降低至2％，并且受到CSF量的影響[3,4]，因此需要通過臨床上一些容易獲得的CSF細(xì)胞學(xué)、常規(guī)、生化等檢查結(jié)果預(yù)測(cè)抗酸陽性的比例，提高TBM的診斷。
　　 對(duì)確診為TBM患者的腦脊液(Cerebrospinalfluid,CSF)細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，不同患者CSF細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)不同，同一患者不同時(shí)期的表現(xiàn)亦不同，推測(cè)可能和患

4、者的易感性有關(guān)。加拿大McGill大學(xué)健康中心調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全世界約有20億人感染Mtb，但最終發(fā)病者不到10％，而TBM僅占其中極小一部分，這些結(jié)果充分說明了某些個(gè)體對(duì)TBM存在易感性。目前對(duì)雙胞胎的研究，對(duì)患有先天性免疫缺陷疾病兒童的研究以及全基因組掃描篩選易感基因和候選基因的研究均表明，宿主的基因強(qiáng)烈影響結(jié)核病的易感性[5-8]。在肺外結(jié)核病人中，免疫反應(yīng)基因的改變例如腫瘤壞死因子α(Tumornecrosisfactor-α，TNF

5、-α)[9]、Toll樣受體2(Toll-likereceptors2，TLR2)[1]、P2X7[10]，可能部分解釋了Mtb更容易由肺部擴(kuò)散到其他組織例如腦的原因。目前有研究報(bào)道在越南人群中Toll樣受體2(Toll-likereceptors2，TLR2)基因的T597C多態(tài)性位點(diǎn)與TBM的易感性相關(guān)[1，11]，但經(jīng)過維普期刊數(shù)據(jù)庫、PubMed、ScienceDirect等多個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，尚無在中國南方漢族人群中與TBM易

6、感相關(guān)性的研究報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬通過CSF細(xì)胞學(xué)、常規(guī)、生化等檢測(cè)結(jié)果，尋找出對(duì)TBM患者CSF抗酸染色陽性有提示價(jià)值的指標(biāo)，從而預(yù)測(cè)抗酸染色陽性的比例，為提高TBM早期診斷水平尋求常規(guī)解決途徑。同時(shí)通過病例對(duì)照研究，揭示TLR2T597C基因多態(tài)性與中國南方漢族人群TBM易感性的關(guān)系，為進(jìn)一步的疾病相關(guān)性和遺傳進(jìn)化研究提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　 方法
　　 選取南方醫(yī)院2009年9月至2011年7月疑診TB

7、M并進(jìn)行CSF檢查的334例標(biāo)本，根據(jù)2010國際TBM協(xié)作組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，選擇符合確診標(biāo)準(zhǔn)患者的83例CSF標(biāo)本，去除合并惡性腫瘤、HIV感染、自身免疫系統(tǒng)疾病患者的28例CSF標(biāo)本，去除常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目缺項(xiàng)18例CSF標(biāo)本，去除PCR陽性的7例CSF標(biāo)本，剩余CSF標(biāo)本30例納入研究，分為兩組，即抗酸染色陽性組(10例)和抗酸染色陰性組(20例)。易感基因研究中分TBM組、肺結(jié)核組及正常對(duì)照組。其中TBM組為2009年9月至2

8、011年5月就診于南方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科符合2010年國際TBM協(xié)作組確診標(biāo)準(zhǔn)[12]的患者;肺結(jié)核組為2011年12月廣州市胸科醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者。肺結(jié)核病人納入標(biāo)準(zhǔn)[1]:臨床和影像學(xué)未發(fā)現(xiàn)有肺外結(jié)核證據(jù)，且痰檢抗酸桿菌(涂片或培養(yǎng))呈陽性;正常對(duì)照組為20例漢族無親緣關(guān)系的健康人。所有納入的研究對(duì)象均為中國南方漢族人，均排除惡性腫瘤、HIV感染及自身免疫性疾病。所有采血及CSF對(duì)象均簽署知情同意書。
　　 細(xì)胞學(xué)研究中收集的C

9、SF1管(＞2mL)送往南方醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行常規(guī)、生化檢查及病原學(xué)檢查(培養(yǎng)、抗酸染色及PCR)，1管(＞2mL)送往神經(jīng)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行CSF細(xì)胞學(xué)檢查(MGG染色)及Ziehl-Neelsen抗酸染色。易感基因研究中采集入組患者外周靜脈血(使用EDTA抗凝管)或CSF，采集標(biāo)本后無菌條件下迅速分裝于凍存管后置于液氮中，凍結(jié)后轉(zhuǎn)移到＞80℃冰箱中保存，統(tǒng)一提取基因組DNA。采用QIAampDNABloodMiniKit(QIAGEN，51

10、104，USA)提取基因組DNA。根據(jù)GenBank公布的人類TLR2基因信息(rs3804099)，用Oligo6.0及primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，對(duì)TLR2基因編碼區(qū)翻譯起始部位進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的上游引物為:5'-TTTTCTTCCCTGGGCAGTC-3';下游引物為:5'-TCGCAGTTCCAAACATTCC-3'。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為400bp。將PCR產(chǎn)物送往華大基因測(cè)序。對(duì)照參考序列，在BLAST數(shù)

11、據(jù)庫中對(duì)比測(cè)序結(jié)果獲得TLR2基因多態(tài)性位點(diǎn)的信息。
　　 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。CSF細(xì)胞學(xué)研究中采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法篩選抗酸染色陽性的可能影響因素，采用Logistic回歸法分析抗酸染色陽性的影響因素，采用Roc曲線建立預(yù)測(cè)值的界值;易感基因研究中采用t檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行描述，采用x2檢驗(yàn)對(duì)組間等位基因和基因型頻率進(jìn)行比較。對(duì)正常對(duì)照組基因分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)，P＜0.05為差異具

12、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在CSF白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比、漿細(xì)胞百分比、CSF蛋白、CSF糖/血糖比值、CSF氯化物、CSF腺苷脫氨酶、腰穿壓力中，僅有淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比、漿細(xì)胞百分比、CSF糖/血糖比在抗酸陽性組和陰性組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用Logistic回歸方法對(duì)篩選出的有意義指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)

13、計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，只有中性粒細(xì)胞百分比、漿細(xì)胞百分比及CSF糖/血糖比值進(jìn)入回歸方程。ROC曲線結(jié)果依此表明:中性粒細(xì)胞百分比≥37.5％，抗酸染色呈陽性的敏感性80％，特異性65％;漿細(xì)胞百分比≥2.5％，敏感性80％，特異性85％;CSF糖/血糖比≤0.285，敏感性70％，特異性80％;回歸方程logit(P)=β0+β1x1+β2x2+...+βpxp中，P值≥0.3977654，敏感性80％，特異性90％。
　　 易感基因研

14、究中包含9例TBM組病人，20例肺結(jié)核組病人及20例健康對(duì)照。TBM組平均年齡為32.7±12.1歲，男2例，女7例。肺結(jié)核組平均年齡為38.3±14.8歲，健康對(duì)照組平均年齡為25.0±2.4歲，兩組中男女均為10例。TBM及肺結(jié)核組年齡上無顯著性差異。對(duì)照組經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)顯示來自遺傳平衡群體。由于樣本數(shù)較少，597CC基因型出現(xiàn)的頻率較低，故將597TC，597CC基因型合稱為變異基因型。變異基因型在對(duì)照組、

15、肺結(jié)核組及TBM組中的頻率分別為55％(11/20)，65％(13/20)，89％(8/9)，在三組間無顯著性差異(x2=3.560，P=0.169)，在對(duì)照組與結(jié)核病組(包括肺結(jié)核組及TBM組)間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2＝1.584，P＝0.208，OR=2.15，95％CI:0.65～7.13)。597C等位基因在對(duì)照組、肺結(jié)核組及TBM組中的頻率分別為30％(12/40)，38％(15/40)，61％(11/18)，三組間無顯著性差異

16、(x2＝5.108，P=0.078)，在對(duì)照組與結(jié)核病組間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2＝2.192，P=0.139，OR=1.90，95％CI:1.81～4.44)。變異基因型及597C等位基因在TBM組中的頻率均明顯高于對(duì)照組，但由于受檢驗(yàn)例數(shù)所限，檢驗(yàn)效能較低(N=49，Power＜0.5)，暫未得出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。
　　 討論
　　 對(duì)CSF細(xì)胞學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞百分比增高、CSF糖/血糖比值降低與CSF抗酸

17、染色陽性率有關(guān)?？赏ㄟ^CSF細(xì)胞學(xué)、常規(guī)、生化等檢驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)抗酸染色陽性率，提高臨床醫(yī)生對(duì)TBM診斷的預(yù)測(cè)性。但是由于標(biāo)本例數(shù)有限，有些可能與抗酸陽性有關(guān)的指標(biāo)尚未得出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，例如CSF淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比，需要增加樣本量進(jìn)一步分析。而對(duì)確診的TBM患者CSF細(xì)胞學(xué)的動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，同一患者不同時(shí)期表現(xiàn)不同，提示在TBM不同疾病進(jìn)程有多種不同的炎癥基因參與。我們假設(shè)這些基因的改變與CSF細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)以及

18、人群對(duì)TBM的易感性存在著因果關(guān)系，并且其中一部分屬于TBM的炎癥易感基因。
　　 因此，我們檢索了既往的研究文獻(xiàn)，同時(shí)進(jìn)行了CSF基因芯片的初步篩查，選定TLR2基因作為研究靶點(diǎn)，首次研究了中國南方漢族人群中位于TLR2翻譯起始位點(diǎn)的T597C單核苷酸多態(tài)性與結(jié)核病尤其是TBM的相關(guān)性。TLR2基因T597C單核苷酸多態(tài)性在不同的種群、地區(qū)間的分布具有明顯的差異。在本研究中，正常南方漢族人群中597T等位基因出現(xiàn)的頻率為70％

19、(28/40)，而在正常高加索人群中597T等位基因出現(xiàn)的頻率為3％(3/110)[13]，然而在越南及日本正常人群中出現(xiàn)的頻率分別為75％(564/754)，50％(24/48)[14]，可見597T等位基因在高加索人群中為次要基因，而在亞洲人群中為常見基因，這些差異可能影響基因的功能。
　　 Thuong等[1]在越南對(duì)183例肺結(jié)核患者，175例TBM患者與389份新生兒臍帶血做對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，TLR2基因T597C單核苷酸

20、多態(tài)性與結(jié)核病易感性相關(guān)，而將肺結(jié)核組和TBM組分別與對(duì)照組對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，T597C與肺結(jié)核無關(guān)，而與TBM相關(guān)，尤其在TBM合并有粟粒性肺結(jié)核患者中更顯著，并且與TBM的嚴(yán)重程度也相關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，TLR2基因T597C位點(diǎn)聯(lián)合含TLR結(jié)構(gòu)域的蛋白分子基因(TIRdomain-containingadapterproteinTIRAP)的C558T位點(diǎn)突變?cè)黾恿薚BM的易感性。Caws等[11]在越南人群中也通過對(duì)187例TBM患者、

21、237例肺結(jié)核患者及389例對(duì)照者的研究發(fā)現(xiàn)，TLR2基因T597C單核苷酸多態(tài)性與TBM易感相關(guān)，而與肺結(jié)核無關(guān)，但這種易感性僅限于在北京菌株引起的TBM中，而其他菌株引起的TBM尚不明確。為研究T597C單核苷酸多態(tài)性在中國南方漢族人群中與結(jié)核病尤其是TBM的相關(guān)性，我們對(duì)肺結(jié)核組、TBM組以及對(duì)照組進(jìn)行病例對(duì)照研究，研究發(fā)現(xiàn)在TBM組中變異基因型和597C等位基因的頻率明顯高于對(duì)照組，T597C單核苷酸多態(tài)性與結(jié)核病尤其是TBM可

22、能存在相關(guān)性，與Thuong、Caws等人在越南的研究結(jié)果基本一致，但由于受檢驗(yàn)例數(shù)所限，檢驗(yàn)效能較低(＜0.5)，暫未得出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。
　　 總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞百分比增高、CSF糖/血糖比值降低對(duì)CSF抗酸染色陽性有重要的提示作用，并通過對(duì)TBM患者CSF細(xì)胞學(xué)的動(dòng)態(tài)觀察推測(cè)基因易感性的存在，但是對(duì)易感基因的研究尚不能證明TLR2基因T597C單核苷酸多態(tài)性與中國南方漢族人群TBM及肺結(jié)核的易感性相關(guān)，