A型急性主動脈夾層的分子機制研究與預(yù)后評價.pdf

1、第一部分 A型急性主動脈夾層主動脈組織差異表達基因的篩選和驗證
　　目的:急性主動脈夾層(Acute aortic dissection，AAD)是臨床常見的危急重癥，具有較高的致死性，但其分子機制尚未闡明。本研究通過全基因組轉(zhuǎn)錄譜芯片分析篩選AAD患者病變主動脈組織和正常對照主動脈組織差異表達的基因，通過生物信息學(xué)分析挑選核心差異表達基因在蛋白水平進行驗證，為后續(xù)尋找新的有關(guān)主動脈夾層發(fā)生的重要信號傳導(dǎo)途徑和重要基因及探討這些基

2、因在AAD發(fā)生、發(fā)展中的作用和機制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:采用標(biāo)準(zhǔn)的組織收集方法分別收集8例AAD患者和8例正常器官捐獻者的升主動脈標(biāo)本。AAD患者和正常對照各選取4例升主動脈組織標(biāo)本進行全基因組表達譜芯片分析，篩選AAD患者和正常對照主動脈組織差異表達的基因，利用生物信息學(xué)分析差異表達的基因可能的生物學(xué)功能，根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果挑選可能在AAD發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用的信號傳導(dǎo)通路和核心基因;然后提取8例AAD患者和8例正常對照

3、的主動脈組織蛋白，通過Western blotting驗證mRNA表達明顯差異的核心基因在AAD患者和正常對照主動脈組織中的蛋白表達差異;由于轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transform growth factor-β，TGF-β)信號通路是已知的與AAD發(fā)生相關(guān)的分子通路，同時在8例AAD患者和8例正常對照主動脈組織中通過Westernblotting分析了TGF-β通路中關(guān)鍵分子SMAD2和SMAD3的蛋白表達是否有差異。
　　結(jié)果:

4、(1)基因表達譜芯片分析顯示，AAD患者病變主動脈組織與正常對照主動脈組織比較，mRNA表達差異大于2倍的基因有129個，其中83個基因表達上調(diào)，46個基因表達下調(diào)。生物信息學(xué)分析提示，差異表達的基因主要涉及粘附斑(FN1、ITGA9、PAK7、COL6A3、FLNC)和肌動蛋白骨架調(diào)節(jié)(FN1、ITGA9、PAK7、PIP5K1B,RRAS2)兩條信號通路，其中ITGA9基因是編碼整合素α9亞基的基因，在兩條信號傳導(dǎo)通路中具有關(guān)鍵作用

5、，表達下調(diào)達50％。因此本研究挑選了ITGA9作為可能與AAD發(fā)病相關(guān)的核心關(guān)鍵基因;(2) Western blotting分析證實，AAD患者主動脈組織中ITGA9的表達顯著低于正常對照（P=0.003）;(3) Western blotting分析顯示，AAD患者病變主動脈組織中磷酸化-SMAD2(p-SMAD2)表達下調(diào)（P＜0.05），而總SMAD2、總SMAD3、磷酸化-SMAD3(p-SMAD3)和正常對照無顯著差異（P值

6、均＞0.05）。
　　結(jié)論:通過組織表達譜芯片分析發(fā)現(xiàn)AAD患者病變主動脈組織和正常對照主動脈組織的基因表達譜有較大差異。生物信息分析顯示，主動脈夾層病變組織中表達明顯差異的兩條通路是粘附斑和肌動蛋白骨架調(diào)節(jié)相關(guān)通路，其中ITGA9基因是同時參與兩條通路的核心基因;在蛋白水平證實AAD患者病變主動脈組織的ITGA9表達降低，而傳統(tǒng)TGF-β信號通路中的p-SMAD2蛋白表達水平在AAD患者中顯著降低，但其他關(guān)鍵成分無明顯變化，提示

7、ITGA9基因可能是參與AAD發(fā)生的重要基因，需要進一步的功能研究驗證其在AAD發(fā)生發(fā)展中的作用;p-SMAD2是否與ITGA9相互作用參與AAD發(fā)病機制尚需要進一步實驗研究。
　　第二部分 ITGA9對大鼠主動脈血管平滑肌細胞表型的影響
　　目的:主動脈中層退行性變是目前被廣為認(rèn)同的主動脈夾層的主要發(fā)病機制，但其確切的分子機制尚不明確。血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)是維持

8、主動脈正常結(jié)構(gòu)和功能的主要成分。VSMC有收縮型和合成型兩種表型，VSMC的表型轉(zhuǎn)換是主動脈退行性變的分子機制之一。前期實驗中我們通過基因芯片和蛋白水平驗證發(fā)現(xiàn)整合素α9亞基的編碼基因ITGA9在AAD患者病變主動脈組織中表達顯著低于正常對照。由于ITGA9在主動脈VSMC胞膜表達，且同時參與細胞粘附和骨架蛋白調(diào)節(jié)通路，因此推測ITGA9在AAD的發(fā)病中可能具有重要作用。本實驗部分?jǐn)M通過細胞學(xué)實驗研究ITGA9表達改變對VSMC表型的影

9、響，探討ITGA9表達下調(diào)在AAD發(fā)病中的可能機制。
　　方法:首先通過組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC并證實大鼠主動脈VSMC表達ITGA9;然后將熒光標(biāo)記的小分子RNA探針轉(zhuǎn)染VSMC，觀察小分子RNA在大鼠VSMC中的轉(zhuǎn)染效率;明確小分子RNA可轉(zhuǎn)染大鼠VSMC后，針對大鼠ITGA9基因設(shè)計特異性的短鏈干擾RNA(Short interfering RNA，siRNA)，轉(zhuǎn)染大鼠VSMC敲低VSMCITGA9的表達，W

10、estern blotting檢測ITGA9敲低后VSMC收縮型標(biāo)志物(SM22α和α-SMA)和合成型標(biāo)志物（OPN和SMemb）表達變化以及細胞劃痕試驗觀察ITGA9敲低后VSMC增殖、遷移能力的變化;最后構(gòu)建腺病毒—ITGA9重組載體，包裝腺病毒，感染經(jīng)血小板源性生長因子(PDGF)誘導(dǎo)呈合成型的VSMC過表達ITGA9，Westernblotting檢測過表達ITGA9后VSMC收縮型標(biāo)志物（SM22α和α-SMA）和合成型標(biāo)志

11、物(SMemb)表達變化。
　　結(jié)果:(1)組織塊貼壁法成功培養(yǎng)出原代大鼠主動脈VSMC并經(jīng)免疫熒光所鑒定;(2) Western blotting證實，大鼠主動脈VSMC表達ITGA9，為下一步干預(yù)ITGA9的表達奠定了基礎(chǔ);(3)熒光標(biāo)記的小分子RNA能順利轉(zhuǎn)染大鼠主動脈VSMC;(4)針對ITGA9設(shè)計的三條siRNA，其中一條能高效敲低VSMC中ITGA9的表達;(5)ITGA9敲低后，經(jīng)Western blotting證

12、實，VSMC收縮型標(biāo)志物（SM22α和α-SMA）表達降低，合成型標(biāo)志物（OPN和SMemb）表達升高;細胞劃痕試驗顯示，ITGA9敲低后VSMC增殖、遷移能力增強，提示VSMC表型從收縮型向合成型轉(zhuǎn)換;(6)成功構(gòu)建腺病毒-ITGA9重組載體，腺病毒包裝后病毒滴度達病毒滴度達1×109PFU/mL;(7)重組腺病毒感染大鼠主動脈VSMC過表達ITGA9后，VSMC收縮型標(biāo)志物SM22α顯著升高（P=0.017），α-SMA表達也升高（

13、P=0.119），SMemb表達降低（P=0.104），但未到達統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:ITGA9表達改變會引起VSMC表型的轉(zhuǎn)化，ITGA9的低表達可能通過誘導(dǎo)VSMC從收縮型向合成型轉(zhuǎn)換參與AAD的發(fā)生。本實驗結(jié)果提示ITGA9基因表達異常可能參與主動脈夾層發(fā)生的分子機制。
　　第三部分入院時D-二聚體水平對A型急性主動脈夾層患者短期和長期死亡的影響
　　目的:D-二聚體是交聯(lián)的纖維蛋白降解產(chǎn)物，其升高提示凝血和纖

14、溶系統(tǒng)的激活。先前研究提示D-二聚體可作為輔助診斷或排除急性主動脈夾層(Acute aorticdissection，AAD)的分子標(biāo)志物，但其作為預(yù)后評估因素的研究較少。本研究通過相對大樣本的研究評估入院時D-二聚體水平對A型AAD患者住院期間和長期隨訪死亡的影響，旨在探討入院時D-二聚體水平對AAD短期和長期預(yù)后的預(yù)測價值。
　　方法:本研究設(shè)計為單中心、前瞻性、觀察性研究，研究對象為連續(xù)入選從2010年3月至2011年6月就

15、診于阜外心血管病醫(yī)院急診中心并經(jīng)CT證實的A型AAD患者。排除標(biāo)準(zhǔn)為主動脈壁內(nèi)血腫、主動脈透壁潰瘍、外傷性主動脈破裂、醫(yī)源性夾層、妊娠、馬凡綜合征、家族性胸主動脈夾層等。采集患者入院時的基線資料，檢測患者入院時D-二聚體水平，并記錄患者住院期間的其他臨床資料。主要終點事件為住院期間全因死亡率和長期隨訪全因死亡率。首先比較存活患者和死亡患者入院時D-二聚體水平的差異;然后按入院時D-二聚體水平四分位分組比較各組患者住院死亡率和長期死亡率;

16、通過單因素和多因素Cox回歸分析入院時D-二聚體水平和住院死亡和長期死亡的相關(guān)性。由手術(shù)治療對患者預(yù)后有顯著影響，將患者分為手術(shù)治療組和保守治療組，比較兩組中不同D-二聚體水平(＞6.10μ g/mL和≤6.10μg/mL)的患者住院死亡率和長期死亡率的差異。
　　結(jié)果:入選2010年3月至2011年6月間就診于阜外心血管病醫(yī)院并經(jīng)主動脈CT檢查確診的AAD患者共375例，其中A型AAD225例，B型AAD150例。排除13例患者

17、臨床資料不全、失訪或符合排除標(biāo)準(zhǔn)，共212例A型AAD進入統(tǒng)計分析。患者中位住院天數(shù)14天（25％～75％，9～20天），出院后中位隨訪時間18.8月(25％～75％，6.7～24.4月)?；颊咂骄挲g48.5±11.5歲，男性比例較高(75.9％)。住院期間全因死亡率和長期隨訪全因死亡率分別為12.7％(27/212)和12.4％(23/185)。與存活者相比，死亡患者入院時D-二聚體水平顯著增高（中位數(shù)6.8 vs.2.5μg/mL

18、，P＜0.001）、白細胞計數(shù)、肌酐水平也顯著高于存活組患者（P值均＜0.001)，但接受手術(shù)治療的比例顯著低于存活組患者（14.0％ vs.74.7％，P＜0.001）。將患者按入院時D-二聚體四分位分組(Q1:≤1.06μ g/mL; Q2:1.07～2.82μ g/mL; Q3:2.83～6.10μ g/mL; Q4:＞6.10μ g/mL)，第四分位(Q4)組患者住院期間死亡率(30.2％)和長期隨訪死亡率(24.3％)均顯著高

19、于其他組患者（P＜0.001和P=0.046)。多因素Cox回歸分析顯示，在校正了其他影響住院期間死亡和長期隨訪死亡的因素后，入院時D-二聚體＞6.10μ g/mL是影響A型AAD患者住院期間死亡的獨立危險因素（HR=6.124，95％CI1.345-27.892，P=0.019），但入院時D-二聚體水平和AAD患者長期死亡無顯著相關(guān)性。是否接受手術(shù)治療是影響AAD患者住院期間死亡和長期隨訪死亡最主要因素。將患者按是否接受手術(shù)治療分組后

20、，接受手術(shù)治療的患者中，入院時D-二聚體＞6.10μ g/mL和≤6.10μ g/mL的患者比較住院期間死亡率和長期隨訪死亡率無顯著差異，而保守治療的患者中，入院時D-二聚體＞6.10μ g/mL的患者住院期間死亡率和長期隨訪死亡率均顯著高于入院時D-二聚體≤6.10μ g/mL的患者。
　　結(jié)論:(1)手術(shù)治療是降低A型AAD患者住院期間死亡和長期死亡的主要措施;(2)入院時D-二聚體水平增高(＞6.10μ g/mL)增加住院期