曲克蘆丁對STZ糖尿病大鼠認知功能障礙及海馬谷氨酸半胱氨酸連接酶亞單位GCLC、GCLM的影響.pdf

1、目的:糖尿病是當代危害人類健康的三大疾病之一，糖尿病中樞神經系統(tǒng)病變是目前研究熱點之一，主要表現(xiàn)為認知功能障礙如學習、記憶能力下降。氧化應激是其重要發(fā)病機制之一。過氧化脂質(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是反映體內的氧化應激水平的經典指標。SOD、GSH均具有很強的抗氧化能力，谷氨酰半胱氨酸連接酶(Glutam

2、atecysteine ligase，GCL)是GSH的合成限速酶，其催化亞基GCLC和調節(jié)亞基GCLM是非常重要的抗氧化蛋白酶，對抗氧化應激能力的提高有重要作用。本實驗以α-硫辛酸為對照，觀察曲克蘆丁對認知功能及氧化應激相關指標(MDA，SOD，GSH，GCLC，GCLM)的影響，為糖尿病認知障礙治療提供新方向。
　　 方法:
　　 1、STZ糖尿病大鼠模型制備
　　 雄性Sprague Dawley(SD)大

3、鼠，腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)60mg/kg，72小時后尾靜脈取血測血糖，血糖值大于等于16.7mmol/L者納入STZ糖尿病大鼠。
　　 2、分組
　　 SD大鼠共70只，150g-170g，隨機分為:正常對照組(NC，10只)，糖尿病組（DM，60只）;動物成模后第12周，糖尿病組隨機分為:生理鹽水組（DN，腹腔注射等體積生理鹽水，15只），糖尿病對照組(DC，15只)，α-硫辛酸干預

4、組（DL，α-硫辛酸60mg/kg/d腹腔注射，15只），曲克蘆丁干預組（DT，曲克蘆丁60mg/kg/d腹腔注射，15只），均干預6周。
　　 3、一般觀察
　　 大鼠精神狀態(tài)，進食量，進水量，尿量，血糖，體重情況。
　　 4、行為學觀察
　　 分別于成模第1、12、18周行Morris水迷宮實驗，記錄大鼠逃避潛伏期，分析各組大鼠學習記憶能力。
　　 5、標本制備及觀察指標
　　 成模第

5、18周（即給藥6周后），取新鮮海馬組織，用HE染色法觀察海馬組織結構，應用黃嘌呤氧化酶法測定海馬SOD的活力，硫代巴比妥酸法測定海馬MDA含量，雙縮脲法測定GSH含量，提取DNA并應用Real-TimePCR法檢測GCLC、GCLMmRNA的表達量，提取蛋白應用蛋白質印跡(Western blot)法檢測GCLC、GCLM蛋白含量。
　　 6、統(tǒng)計學方法
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包，對所測定結果進行正態(tài)性及方差

6、齊性檢驗，應用重復測量方差分析、多元方差分析及完全隨機設計的單因素方差分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)，用(x)±s表示統(tǒng)計結果，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、一般情況觀察
　　 正常對照組大鼠皮毛純白有光澤，精神狀態(tài)良好，反應靈敏，飲水量、進食量及尿量正常，體重穩(wěn)步增長;糖尿病組大鼠毛色稀疏枯黃污穢且無光澤，皮膚變薄，易激惹，精神萎靡，多尿、多飲、多食、體重明顯下降(P＜0.05)，血糖較正常組明顯升高

7、(P＜0.01)。
　　 2、行為學觀察（Morris水迷宮結果）
　　 成模第1周，糖尿病組與正常對照組間無顯著差別（P＞0.05）;
　　 成模第12周（藥物干預前），糖尿病組較正常對照組逃避潛伏期明顯延長(P＜0.05);
　　 成模第18周（藥物干預6周后），α-硫辛酸干預組與曲克蘆丁干預組均較糖尿病對照組及糖尿病鹽水組逃避潛伏期明顯縮短，但仍高于正常對照組(P＜0.05);α-硫辛酸干預組與曲克

8、蘆丁干預組間無顯著差異(P＞0.05);糖尿病鹽水組與糖尿病對照組間無顯著差異（P＞0.05），組別和天數(shù)之間不存在交互作用(P＞0.05)。
　　 3、海馬組織GCLMmRNA及蛋白的表達
　　 3.1、海馬組織GCLMmRNA的表達
　　 與正常對照組(1±0)相比，糖尿病對照組（0.790±0.012）、糖尿病鹽水組（0.863±0.097）海馬GCLMmRNA的表達顯著降低（P＜0.05）;糖尿病對照組與

9、糖尿病鹽水組間無顯著差異(P＞0.05)。與糖尿病對照組及糖尿病鹽水組相比，α-硫辛酸干預組（1.510±0.115）與曲克蘆丁干預組（1.207±0.011）海馬GCLMmRNA的表達顯著增高（P＜0.05）;α-硫辛酸干預組GCLMmRNA表達高于曲克蘆丁干預組（P＜0.05）。
　　 3.2、海馬組織GCLM蛋白表達
　　 正常對照組（1±0）、糖尿病對照組（0.999±0.003）、糖尿病鹽水組（1.000±0.

10、002）、α-硫辛酸干預組（0.999±0.001）、曲克蘆丁干預組（0.999±0.002）之間無明顯差異。
　　 4、海馬組織GCLCmRNA及蛋白的表達
　　 4.1、海馬組織GCLCmRNA及蛋白的表達
　　 與正常對照組（1±0）相比，糖尿病對照組（0.642±0.118）、糖尿病鹽水組（0.660±0.123）海馬GCLMmRNA的表達顯著降低(P＜0.05);糖尿病對照組與糖尿病鹽水組間無顯著差異（

11、P＞0.05）。與糖尿病對照組及糖尿病鹽水組相比，α-硫辛酸干預組（1.245±0.128）與曲克蘆丁干預組（1.181±0.131）海馬GCLMmRNA的表達顯著增高(P＜0.05);α-硫辛酸干預組與曲克蘆丁干預組無顯著差異(P＞0.05)。
　　 4.2、海馬組織GCLC蛋白的表達
　　 與正常對照組（1±0）相比，糖尿病對照組（0.989±0.002）、糖尿病鹽水組（0.989±0.001）海馬GCLC蛋白水平顯

12、著降低(P＜0.05);糖尿病對照組與糖尿病鹽水組間無顯著差異(P＞0.05)。與糖尿病對照組及糖尿病鹽水組相比，α-硫辛酸干預組（1.009±0.003）與曲克蘆丁干預組（1.002±0.001）海馬GCLC蛋白水平顯著增高（P＜0.05）;α-硫辛酸干預組蛋白表達高于曲克蘆丁干預組(P＜0.05)。
　　 5、海馬組織中SOD活性及MDA、GSH含量測定
　　 5.1、SOD活性(U/mgprot)
　　 與

13、正常對照組（115.976±7.581）相比，糖尿病對照組（61.806±3.942）、糖尿病鹽水組（68.237±7.632）海馬SOD活性明顯降低（P＜0.05）;糖尿病對照組與糖尿病鹽水組間無顯著差異(P＞0.05)。與糖尿病對照組及糖尿病鹽水組相比，α-硫辛酸干預組（200.331±6.181）與曲克蘆丁干預組（191.985±11.421）海馬SOD活力明顯升高（P＜0.05），并且高于正常對照組(P＜0.05);α-硫辛酸干

14、預組與曲克蘆丁干預組間無顯著差異（P＞0.05)。
　　 5.2、MDA含量(nmol/mgprot)
　　 與正常對照組（2.737±0.208）相比，糖尿病對照組（3.841±0.109）、糖尿病鹽水組(3.722±0.196)海馬MDA含量明顯升高（P＜0.05）;糖尿病對照組與糖尿病鹽水組間無顯著差異（P＞0.05）。與糖尿病對照組及糖尿病鹽水組相比，α-硫辛酸干預組（2.022±0.228）與曲克蘆丁干預組（2

15、.534±0.197）海馬MDA含量明顯降低(P＜0.05);曲克蘆丁干預組與正常對照組間無顯著性差別(P＞0.05)，α-硫辛酸干預組海馬MDA含量低于曲克蘆丁干預組及正常對照組(P＜0.05)。
　　 5.3、GSH含量(mg/gprot)
　　 糖尿病對照組（2.117±0.158）和糖尿病鹽水組（2.114±0.150）均低于正常對照組（2.657±0.207）（P＜0.01）;糖尿病對照組和糖尿病鹽水組相比無統(tǒng)

16、計學差異(P＞0.05);α-硫辛酸干預組（4.337±0.174）和曲克蘆丁干預組（3.634±0.177）與糖尿病對照組和糖尿病鹽水組相比均增高(P＜0.01);α-硫辛酸干預組高于曲克蘆丁干預組(P＜0.01)。
　　 6、HE染色結構
　　 正常對照組大鼠海馬椎體細胞元排列整齊，形態(tài)完整;糖尿病對照組及糖尿病鹽水組細胞數(shù)目減少，細胞膜及核仁模糊，細胞結構被破壞，核固縮，細胞質減少;α-硫辛酸干預組及曲克蘆丁干預組

17、較糖尿病對照組及糖尿病鹽水組上述改變明顯減輕。
　　 結論:
　　 1、STZ糖尿病大鼠的學習記憶能力明顯下降;與學習記憶密切相關的海馬組織中:重要的抗氧化物質SOD、GSH顯著減低，合成GSH的關鍵酶GCLC、GCLM的表達亦減少;氧化應激產物MDA的產生增加。
　　 2、α-硫辛酸可改善STZ糖尿病大鼠學習記憶能力，提高海馬組織中SOD、GSH及GCLC、GCLM的表達，降低MDA的生成。
　　 3、