人脂肪干細胞行Edu標(biāo)記效果的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 人脂肪干細胞(ADSC，Adipose-derivedstemcells)是從脂肪組織中分離出來的，并能顯示出持續(xù)的細胞增殖能力及向小同組織細胞定向分化的能力的細胞，具有組織量多，來源廣泛的優(yōu)點。近年來，被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及臨床細胞治療中，且具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＷ泽w脂肪移植在整形外科中廣泛應(yīng)用，但成活率低，需重復(fù)治療等缺點是整形外科醫(yī)生面臨的重大問題。為了解決這一問題，需要對脂肪成活機制準(zhǔn)確把握。在脂肪成活

2、過程中，ADSC的作用尤為明顯。一些理論推斷脂肪干細胞的作用通過脂肪干細胞的增炳、分化成新的脂肪組織并提供適應(yīng)的環(huán)境來促進脂肪的成活，但未有定論，且需要更多、更準(zhǔn)確的實驗來回答這一問題。我們的實驗選用一種新的示蹤劑，通過細胞示蹤米探究脂肪干細胞在脂肪移植中的作用機制。Edu是一種核酸類似物，在細胞分裂增殖的過程中參與到核染色體中達到標(biāo)記目的。
　　 目的：
　　 觀察體外培養(yǎng)時不同培養(yǎng)階段的人脂肪干細胞的細胞形態(tài)和生物學(xué)

3、特點。通過實驗初步確立最佳的標(biāo)記濃度及標(biāo)記時間組合。進一步通過與未標(biāo)記的干細胞的進行增殖及分化影響的比較以選出最適標(biāo)記濃度及時間。
　　 方法：
　　 1、人ADSC的體外培養(yǎng)分離、培養(yǎng)和鑒定。經(jīng)知情同意后，取吸脂手術(shù)來源的脂肪顆粒，使用酶消化法獲得SVF細胞，原代培養(yǎng)在7-10天時達80％-90%的細胞融合，干細胞進一步傳代培養(yǎng)進行純化和擴增。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。細胞傳至第3代后，分別用于鑒定細胞及用于細胞標(biāo)

4、記的研究。
　　 2、Edu在不同濃度及時間標(biāo)記的組合下進行研究。分別采5uM，10uM，20uM,50uM的濃度及12小時，24小時進行標(biāo)記，Edu標(biāo)記后的細胞去除含Edu的培養(yǎng)基，制成單細胞懸液并固定細胞，以Alexa-555染色后行流式細胞分析儀檢測標(biāo)記率，從而挑選出各時間點中較適宜的標(biāo)記組合。
　　 3、測定Edu在較適宜的標(biāo)記率情況下對細胞生長及分化的影響，以未標(biāo)記細胞作為空白對照。Edu對干細胞細胞活性及增殖

5、的影響以臺盼藍排斥反應(yīng)及MTT實驗證實。
　　 4、測定Edu標(biāo)記后影響細胞分化的能力。即去除Edu后，脂肪干細胞行定向成脂及成骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)結(jié)束后行油紅O染色及茜素紅染色鑒定分化結(jié)果。數(shù)據(jù)以SPSS13.0進行分析。
　　 結(jié)果：
　　 原代細胞貼壁后呈一定方向的成纖維細胞樣生長。在第5到第7天時細胞克隆逐漸變大并相互融合并形成單層。7-10天時將細胞消化下來并進行傳代。傳代后細胞生長迅速，2-3天即可長滿培養(yǎng)皿

6、的底部并進一步傳代。3代細胞行流式細胞儀分析細胞表型時表達細胞表面標(biāo)志如CD90，CD105，CD44，而且不表達或弱表達細胞表面標(biāo)志CD34，CD45。
　　 Edu的標(biāo)記是在細胞分裂增殖時，新合成的細胞才能被標(biāo)記上。流式結(jié)果表明，分別在10uM，12h和5uM，24h標(biāo)記時，細胞標(biāo)記率可達約90%。更高的濃度并不能明顯提高細胞的標(biāo)記率，且會對細胞活性有影響。因此，選定此兩組作為實驗組，未標(biāo)記細胞作為對照組，分析標(biāo)記后對細胞增

7、殖分化的影響。
　　 標(biāo)記后的細胞即可被消化，制成單細胞懸液。臺盼藍排斥實驗數(shù)據(jù)顯示細胞死亡比例各組問無統(tǒng)計學(xué)差異。MTT實驗分析，三組間10uM，12h與對照組曲線較相近，但略低,5uM，24h與對照組曲線較遠，證實標(biāo)記物對細胞增殖有一定的影響，以10uM，12h組標(biāo)記者影響較小。
　　 標(biāo)記后的細胞去除Edu后定向分化，成脂誘導(dǎo)2周，成骨誘導(dǎo)3周。分別以油紅O染色及茜素紅染色，隨機每高倍鏡視野下計數(shù)成脂細胞數(shù)及鈣結(jié)節(jié)