外源性糖皮質激素誘導的大鼠垂體前葉細胞凋亡和中藥干預作用的實驗研究.pdf

1、一、背景和目的
　　 糖皮質激素(Glucocorticoid,GC)是腎上腺皮質激素的一種,由束狀帶合成和分泌,具有重要的生理學意義。目前,GC已經(jīng)成為臨床各科室廣泛應用的藥物,具有抗炎、抗過敏、抗休克、免疫抑制等藥理作用。但長期大量系統(tǒng)應用GC會產(chǎn)生嚴重的不良反應,諸如感染(病毒、細菌、真菌等)、消化道潰瘍或穿孔、皮質功能亢進或減退、電解質紊亂、骨質疏松或缺血性骨壞死、以及對神經(jīng)精神的影響等,還可加重原有的糖尿病、高血壓等,

2、不適當?shù)耐Ｋ幓驕p量還可引起病情反跳。近年來,在深入研究GC作用機理的同時對減輕其副作用的措施也進行了一系列卓有成效的研究。目前的共識:GC的釋放受到下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal axis,HPAA)的調控,它又對此神經(jīng)內(nèi)分泌環(huán)施行強烈的負反饋作用。GC負反饋作用基本位點除了下丘腦和海馬結構外,主要就是垂體前葉的促腎上腺皮質激素(Adrenocorticotrophic Hormon

3、e,ACTH)細胞。用下丘腦室旁核分泌的促腎上腺皮質激素釋放激素(Corticotropin Release Hormone,CRh)刺激這些細胞導致ACTH的釋放,ACTH是腎上腺皮質合成和釋放GC的主要刺激物。GC對于ACTH細胞功能的負反饋作用發(fā)生在幾個水平上,最具特征性的是對ACTH的合成和釋放以及CRH受體的表達。任何劑量的GC如果抑制了CRH和ACTH的分泌,且在用藥期內(nèi)這種抑制沒有被恢復,均會產(chǎn)生中心性腎上腺分泌不足,久而

4、久之會引起外周腎上腺的萎縮。GC長期治療后的停藥,無論在人還是鼠上均出現(xiàn)了HPAA對內(nèi)源性或者外源性刺激的反應功能降低,這種功能變化反映在HPAA的各層次器官上。有人將鼠腎上腺切除后2周,給予持續(xù)的地塞米松導致了鼠垂體前葉細胞非常顯著的凋亡活動,同時有絲分裂活動被抑制。盡管不可能知道是垂體的哪一類細胞減少,但已經(jīng)提示總的垂體細胞減少到2周前基礎水平以下。LA Nolan等人認為,GC停藥伴隨著短時或長時的HPAA的分泌能力的損傷。這種垂

5、體前葉對GC的反應在鼠上包括了凋亡介導的細胞數(shù)量減少、被損傷細胞的恢復、未定型的前體細胞分化及其他類型分泌細胞的轉化。這預示著,如果有足夠的時間垂體前葉細胞完全恢復是可能的。
　　 中醫(yī)認為,“腎”的功能涉及到垂體.腎上腺皮質系統(tǒng),HPAA是中西醫(yī)結合腎本質研究的一個焦點。近年來國內(nèi)外對腎虛本質和補腎藥作用機理的探討取得了多方面的進展。廣泛涉及內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和基礎代謝等方面。臨床上用補腎方藥治療腎虛病人長能調節(jié)陰陽、改善癥

6、狀恢復健康。補腎中藥與GC合用,可減輕或消除長期應用GC所致的腦垂體前葉細胞的形態(tài)改變。中醫(yī)辨證論治的目的在于腎陰陽平衡上著手調整,使HPAA功能得以恢復。張景岳創(chuàng)制的右歸丸常被作為“陰中求陽”的代表方,它選用大量補陰藥填補命門真陰,以治命門火衰,用少量補陽藥溫陽化氣、直接溫補腎陽。羅漢文等報道,右歸丸可以提高血中可的松濃度,使垂體ACTH細胞數(shù)高于對照組。
　　 基于上述的理論依據(jù),本實驗選用右歸丸作為GC導致HPAA功能抑制

7、的保護性藥物,探討其作用機理可能與減輕GC誘導的垂體前葉細胞凋亡有關。
　　 二、方法
　　 通過外源性給予糖皮質激素建立大鼠腎陽虛模型,即糖皮質激素副作用動物模型,進行體內(nèi)實驗；利用原代培養(yǎng)的垂體前葉細胞進行體外實驗；按照隨機對照的原則分組；應用免疫組織化學染色、TUNEL染色、Real-Time qPCR及流式細胞技術檢測各組垂體前葉細胞的凋亡量、凋亡相關蛋白的表達以及線粒體膜電位的變化；方差分析比較各組的差異,得出

8、結論。
　　 三、結果
　　 體內(nèi)實驗和體外實驗均得出地塞米松加右歸丸組的凋亡細胞數(shù)明顯少于地塞米松組(P<0.05)；凋亡促進蛋白及其mRNA的表達在地塞米松加右歸丸組明顯少于地塞米松組(P<0.05),而抗凋亡蛋白及其mRNA在地塞米松組的表達高于地塞米松組(P<0.05)；線粒體膜電位下降的細胞數(shù)在地塞米松加右歸丸組明顯少于地塞米松組(P<0.05)。
　　 四、結論
　　 本實驗通過大鼠體內(nèi)和體外