CY15-GFP瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤(malignant tumor)最重要的生物學(xué)特征，也是惡性腫瘤導(dǎo)致患者死亡的主要原因。如果沒(méi)有足夠的血供和營(yíng)養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞就無(wú)法生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，因此，新生血管的生成在惡性腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。新生血管不僅可以為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，還為腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)提供條件。隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，腫瘤已成為全人類共同關(guān)心的重大課題，腫瘤新生血管也成為科研重點(diǎn)之一，國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家們都期望通過(guò)對(duì)新生血管的研究來(lái)達(dá)到

2、預(yù)防和控制惡性腫瘤的目的。
　　 新生血管形成常見于炎癥、腫瘤、缺血和創(chuàng)傷愈合等病理過(guò)程，腫瘤的新生血管形成是一個(gè)多種細(xì)胞及因子參與的復(fù)雜的病理過(guò)程，其確切機(jī)制尚未完全清楚。CY15是起源于樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的BALB/c小鼠惡性組織細(xì)胞增生癥細(xì)胞系3，將編碼綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染入CY15細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選得到能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的

3、CY15-GFP細(xì)胞，可以直接在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)83。本實(shí)驗(yàn)將CY15-GFP瘤細(xì)胞植入SD大鼠(Sprague Dawley大鼠)角膜基質(zhì)層囊袋內(nèi)，觀察CY15-GFP瘤細(xì)胞誘導(dǎo)新生血管生成的過(guò)程，探討腫瘤新生血管生成的相關(guān)機(jī)制。
　　 一、研究目的
　　 建立CY15-GFP瘤細(xì)胞誘導(dǎo)新生血管生成的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｌ接懩[瘤新生血管生成的發(fā)生機(jī)制，為腫瘤的治療提供新的途徑。
　　 二、研究方法
　　

4、 1.制作SD大鼠右眼顳側(cè)角膜基質(zhì)層囊袋，實(shí)驗(yàn)組(CY15-GFP組)和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(死細(xì)胞組)分別用微量注射器在囊袋內(nèi)接種1微升(1x104個(gè))CY15-GFP細(xì)胞和福爾馬林固定后的CY15-GFP細(xì)胞，空白對(duì)照組(PBS組)注入同體積PBS。
　　 2.術(shù)后每天裂隙燈觀察術(shù)眼并照相。待實(shí)驗(yàn)組角膜基質(zhì)層新生血管長(zhǎng)至囊袋周圍后行墨汁心臟灌注，角膜新生血管顯影，取角膜制作鋪平片并攝像，HE染色進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)觀察。術(shù)后第1、3、7、

5、10、14天進(jìn)行熒光顯微鏡活體觀察實(shí)驗(yàn)組角膜熒光細(xì)胞并攝像。
　　 3.RT-PCR檢測(cè)CY15-GFP瘤細(xì)胞體外表達(dá)VEGF、MMP9 mRNA的情況。RT-PCR檢測(cè)術(shù)后第7天CY15-GFP組和PBS組角膜組織中VEGF、MMP9的mRNA表達(dá)情況，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)角膜組織中VEGF、MMP9蛋白表達(dá)情況。RT-PCR檢測(cè)術(shù)后第14天CY15-GFP組角膜組織中VEGF、MMP9的mRNA表達(dá)情況。
　　 三、

6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.CY15-GFP組術(shù)后第1天可見角膜輕度水腫，顳側(cè)角鞏緣血管網(wǎng)擴(kuò)張，隨后新生血管芽長(zhǎng)出；術(shù)后第3天，顳側(cè)角膜水腫加重，新生血管向囊袋方向生長(zhǎng)；術(shù)后第7天，新生血管長(zhǎng)至囊袋周圍，隨后角膜水腫不斷減輕，新生血管變稀疏變短；術(shù)后第10天角膜輕度水腫，新生血管較消退明顯；術(shù)后第14天時(shí)新生血管完全消失，角膜恢復(fù)透明。PBS組和死細(xì)胞組術(shù)后第1天顳側(cè)角鞏緣血管網(wǎng)充血，術(shù)后第2天充血減輕，觀察過(guò)程中未見新生血管長(zhǎng)出。

7、r>　　 2.術(shù)后第7天CY15-GFP組角膜組織組織學(xué)檢查見囊袋內(nèi)腫瘤細(xì)胞及新生血管斷面，囊袋周圍淋巴細(xì)胞聚集。墨汁灌注顯示新生血管位于CY15-GFP組角膜。熒光顯微鏡觀察顯示囊袋內(nèi)熒光細(xì)胞在14天時(shí)已全部消失。
　　 3.CY15-GFP瘤細(xì)胞體外表達(dá)VEGF、MMP9mRNA。術(shù)后第7天，CY15-GFP組角膜VEGF、MMP9mRNA表達(dá)均較PBS組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。術(shù)后第7天VEGF、M

8、MP9蛋白主要表達(dá)于CY15-GFP組角膜基質(zhì)層內(nèi)腫瘤細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)照組基質(zhì)層未見表達(dá)。術(shù)后第14天，CY15-GFP組角膜VEGF、MMP9mRNA表達(dá)均較術(shù)后第7天弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。
　　 四、結(jié)論
　　 1.CY15-GFP瘤細(xì)胞植入SD大鼠角膜基質(zhì)層囊袋能誘導(dǎo)新生血管生成。
　　 2.CY15-GFP瘤細(xì)胞誘導(dǎo)新生血管形成的機(jī)制，與局部MMP9、VEGF的mRNA及蛋白表