甲氨蝶呤紅細(xì)胞載體的制備及在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究.pdf

1、目的：紅細(xì)胞作為一種新型藥物載體，具有良好的生物相容性和可降解性，其在體內(nèi)較長的循環(huán)時間賦予了藥物緩釋特性，有利于降低藥物的毒副作用。載藥紅細(xì)胞表明經(jīng)特殊處理后，呈現(xiàn)靶向性和緩慢釋放的特點，尤其對于某些抗腫瘤藥物，可以提高其選擇性和治療效果.本研究通過建立甲氨蝶呤高效液相色譜的測定方法，基于包封率及紅細(xì)胞形態(tài)的改變，摸索和優(yōu)化甲氨蝶呤紅細(xì)胞載體的制備條件。比較甲氨蝶呤紅細(xì)胞載體與普通靜脈制劑在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)及組織分布，為甲氨蝶呤

2、紅細(xì)胞載體是否具有臨床應(yīng)用價值提供實驗依據(jù)。
　　 方法：1.參考文獻資料，采用高效液相色沓紫外檢測法(HPLC-UV)，以C18為固定相，NaH2PO4溶液-甲醇(72:28)為流動相，調(diào)節(jié)流動相pH值為5.5，選擇阿魏酸作為內(nèi)標(biāo)。樣品用10％高氯酸沉淀血漿蛋白，使檢測不受血漿內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，峰分離度良好。實驗分別建立了大鼠和人血漿中甲氨蝶呤濃度的高效液相色譜的測定方法。
　　 2.甲氨蝶呤紅細(xì)胞載體的制備：采用高滲

3、法制備紅細(xì)胞載體，紅細(xì)胞與葡萄糖混合脫水后，正常的雙面凹圓盤狀紅細(xì)胞由于脫水發(fā)生皺縮，體積變小，厚度變薄，趨扁平狀，部分紅細(xì)胞由于血紅蛋白(Hb)選出變成空泡狀。脫水紅細(xì)胞再置于低滲甲氨蝶呤溶液中重漲，得到甲氨蝶呤紅細(xì)胞載體(MTX-RBC)，其平均體積增加，趨于球形，體積變異度增大。制備過程中考察紅細(xì)胞滲透脆性和形態(tài)變化，紅細(xì)胞經(jīng)脫水體積縮小，細(xì)胞內(nèi)滲透壓增高，經(jīng)低滲甲氨蝶呤溶液膨脹使甲氨蝶呤隨滲透壓梯度進入細(xì)胞內(nèi)，其中伴隨紅細(xì)胞形態(tài)

4、功能的變化。
　　 3.甲氨蝶呤紅細(xì)胞載體制備工藝的優(yōu)化：基于紅細(xì)胞載體包封率對制備工藝進行優(yōu)化。紅細(xì)胞載體包封率是指紅細(xì)胞包載甲氨蝶呤的含量與加入甲氨蝶呤總量的百分比。按照正交表格L9(34)設(shè)計，考察不同濃度MTX、全血與高滲葡萄糖比例、脫水時間和藥物浸潤紅細(xì)胞時間4個因素在3種不同水平條件下制備的紅細(xì)胞載體的包封率，由此選定最優(yōu)制備工藝。
　　 4.采用雙周期兩制劑交叉實驗設(shè)計，采集給藥后0，5，10，30，60，

5、120，180，240，360，480，600，720，1440min各時間點血樣，利用高效液相色譜法測定大鼠血漿中甲氨蝶呤的濃度，應(yīng)用藥代動力學(xué)軟件DAS1.0計算甲氨蝶呤普通靜脈制劑和甲氨蝶呤紅細(xì)胞載體的藥代動力學(xué)參數(shù)并進行比較，考察MTX-RBC的緩釋效應(yīng)。
　　 5.比較甲氨蝶呤普通靜脈制劑和甲氨蝶呤紅細(xì)胞載體給藥后5，30，60，120，180，240，300min時間點在大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、腸各組織的濃度?？?/p>

6、察甲氨蝶呤在各組織中的分布特點及載藥紅細(xì)胞是否具有靶向性。
　　 結(jié)果：1.血漿中甲氨蝶呤濃度在0.05-5.00μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9993)，最低檢出濃度為20ng·ml-1，日內(nèi)變異系數(shù)為2％-7％，日間變異系數(shù)為4％-10％，該方法不受血漿內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，適合甲氨蝶呤濃度的測定。
　　 2.包封率測定結(jié)果表明最優(yōu)制備條件如下：全血與高滲葡萄糖比例為3:2，脫水時間為40min，MTX濃度為

7、250μg·ml-1，藥物浸潤紅細(xì)胞時間為30min，在此條件下制備的MTX-RBC包封率在人紅細(xì)胞和大鼠紅細(xì)胞中分別可以達到41.58％和54.69％。
　　 3.紅細(xì)胞我體制備過程中，紅細(xì)胞滲透脆性沒有發(fā)生明顯變化，滲透脆性曲線沒有發(fā)生明顯偏移。正常紅細(xì)胞呈雙面凹圓盤狀，大小均勻；脫水紅細(xì)胞呈扁平餅狀，細(xì)胞體積縮??；MTX-RBC厚度增加，直徑變小，有的細(xì)胞趨于雙面凹圓盤狀，有的趨于球形。
　　 4.藥代動力學(xué)研究顯

8、示，普通靜脈制劑體內(nèi)代謝符合三房室模型，而紅細(xì)胞載體制劑體內(nèi)代謝符合二房室模型。用非房室的統(tǒng)計矩參數(shù)模型擬合得到普通靜脈制劑和紅細(xì)胞載體的Cmax(mg·L-1)分別是13.6±3.7和2.7±1.2，t1/2(h)分別是3.9±0.8和13.5±2.0，AUC0-+∞(mg·L-1·h)分另U是60799.5±11473.8和40583.3±11845.7，MRT0→∞(h)分別是5.7±1.2和19.5±2.9，CL(L·h-1·k

9、g-1)分別是0.27±0.06和0.35±0.07。
　　 5.組織分布實驗結(jié)果顯示兩種制劑在各組織中的變化趨勢基本相同，但MTX濃度變化不同，在大鼠的腎臟和肝臟中分布較多，5h后各組織中的MTX或其代謝物含量已降至檢測限以下。
　　 結(jié)論：建立了人和大鼠血漿中及游離甲氨蝶呤濃度的高效液相色譜測定方法，適合甲氨蝶呤紅細(xì)胞載體相關(guān)研究的進行；通過高滲法制備甲氨蝶呤紅細(xì)胞載體并進行條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)制備過程是紅細(xì)胞先經(jīng)高滲葡萄