葛根素對轉運體介導的甲氨蝶呤藥代動力學、腎損傷、逆轉K562-ADR細胞多藥耐藥的分子藥代動力學機制.pdf

1、第一部分，應用LC-MS/MS建立同時測定生物樣品中甲氨蝶呤和葛根素的分析方法
　　目的:建立一種靈敏、快速、高效、專屬的LC-MS/MS方法用于同時測定生物樣品中甲氨蝶呤和葛根素的濃度。
　　方法:生物樣品經(jīng)甲醇沉淀蛋白后，氮氣吹干并復溶，應用Hypersil ODS-C18色譜柱分離，流動相為乙腈-甲酸水(40∶60，v/v);流速為0.3ml/min。采用電噴霧離子源（ESI源）多反應監(jiān)測（MRM）模式，正離子掃描分析

2、m/z455.2→308.2（甲氨蝶呤），m/z414.9→266.7（葛根素），m/z370.4→288.1（西洛他唑，內(nèi)標）。
　　結果:甲氨蝶呤和葛根素的線性范圍為1～1000 ng/ml，日內(nèi)和日間精密度相對標準差均小于15％。
　　結論:建立了靈敏、快速的LC-MS/MS法同時測定生物樣品中的甲氨蝶呤和葛根素的濃度，并成功應用于藥代動力學研究。
　　第二部分，葛根素影響甲氨蝶呤藥代動力學的分子機制研究

3、　　目的:揭示葛根素影響甲氨蝶呤藥動學的分子機制，為臨床合理用藥提供科學指導。
　　方法:采用大鼠in vivo口服和靜注、in vitro翻轉腸實驗、腎切片攝取實驗以及MDR1-MDCK細胞轉運實驗、OAT1/3-HEK293細胞攝取實驗考察葛根素對甲氨蝶呤藥代動力學的影響和分子機制，生物樣品中葛根素和甲氨蝶呤的含量應用LC-MS/MS檢測。
　　結果:合用葛根素后，甲氨蝶呤的口服生物利用度提高了58％，靜注甲氨蝶呤時腎臟

4、清除率顯著下降（從1.91±0.09 ml/min下降為0.82±0.07 ml/min）。葛根素可顯著提高甲氨蝶呤的體外腸吸收，并抑制腎切片對甲氨蝶呤的攝取。同時，葛根素抑制MDR1-MDCK細胞外排地高辛轉運的IC50為1.6μM，且可顯著抑制甲氨蝶呤經(jīng)MDR1-MDCK細胞的外排轉運。此外，OAT1/3-HEK293細胞攝取葛根素與mock-HEK293沒有差異，但葛根素可抑制OAT1/3-HEK293細胞對經(jīng)典底物（PAH和PC

5、G）和甲氨蝶呤的攝取。
　　結論:葛根素影響甲氨蝶呤藥動學的分子靶點為腸道P-gp和腎臟OATs，葛根素是P-gp和OATs的抑制劑，提示葛根素與甲氨蝶呤或其他P-gp及OATs底物合用時，可能發(fā)生潛在的藥物相互作用。
　　第三部分，葛根素對甲氨蝶呤腎損害的影響及其分子藥代動力學機制
　　目的:通過多劑量的葛根素改善甲氨蝶呤引起的大鼠腎損傷探索轉運體介導葛根素緩解腎損傷的分子藥代動力學機制。
　　方法:大鼠灌胃葛

6、根素(50mg/kg/d)三天后，考察甲氨蝶呤藥代動力學改變。此外，大鼠腹腔注射甲氨蝶呤(7 mg/kg/d)三天后，葛根素灌胃治療三天(50mg/kg/d)，考察大鼠血清肌酐、尿素氮、硫酸吲哚吩的改變以及大鼠腎臟病理切片的變化。
　　結果:葛根素給藥后，甲氨蝶呤的血藥濃度下降增快，腎切片對甲氨蝶呤的攝取增加。Real time PCR實驗表明葛根素誘導Oat1/3的表達，從而加快對甲氨蝶呤的腎清除。甲氨蝶呤連續(xù)給藥后，血肌酐、尿

7、素氮和硫酸吲哚酚等內(nèi)源性代謝物質(zhì)的血漿濃度升高，腎臟出現(xiàn)明顯的病理改變。而合用葛根素并不能避免腎損害的發(fā)生，但是可加快內(nèi)源性代謝物質(zhì)的排泄，通過上調(diào)Oat1/3可改善腎組織的病理改變。同時，葛根素能部分逆轉甲氨蝶呤處理后的BCL6表達下調(diào)和PEG2的表達上調(diào)。
　　結論:葛根素可通過BCL6和PEG2上調(diào)Oat1/3，加快甲氨蝶呤的腎排泄，從而改善甲氨蝶呤誘導的腎毒性。
　　第四部分，葛根素抑制NF-κB通路逆轉K562/A

8、DR細胞多藥耐藥
　　目的:探討葛根素逆轉K562/ADR細胞多藥耐藥的分子機制。
　　方法:通過MTT、qRT-PCR、Western Blotting、流式細胞術以及質(zhì)粒轉染等實驗考察葛根素逆轉K562/ADR細胞對阿霉素的耐藥性及其分子機制。
　　結果:K562/ADR對阿霉素的敏感性顯著降低，并且MDR1/P-gp的表達分別增高了6.58和4.62倍。qRT-PCR和Western Blotting實驗結果證實