膽汁酸衍生物對(duì)大鼠免疫性肝纖維化的阻抑作用及機(jī)制探討.pdf

1、研究背景及目的：肝纖維化(hepatic fibfosis)是諸多慢性肝病發(fā)展至肝硬化過(guò)程中所共有的病理組織學(xué)改變，是影響慢性肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)。其特征是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)各成分因合成增多、降解相對(duì)不足而在肝內(nèi)過(guò)量沉積。肝纖維化為一動(dòng)態(tài)過(guò)程，屬可逆性病變。但若進(jìn)一步發(fā)展致肝小葉結(jié)構(gòu)改建、假小葉形成(肝硬化階段)則不可逆。迄今為止，臨床上還缺乏公認(rèn)的確切有效的抗肝纖維化藥物問(wèn)世，肝纖

2、維化的防治研究在今后一定時(shí)期內(nèi)仍是國(guó)內(nèi)外的熱點(diǎn)與難點(diǎn)課題。 膽汁酸衍生物——熊去氧膽酸(UDCA)是人機(jī)體內(nèi)源性第三步合成的膽汁酸，能拮抗疏水性膽酸的細(xì)胞毒性作用，保護(hù)肝細(xì)胞膜；調(diào)節(jié)免疫功能；抑制細(xì)胞凋亡；清除自由基和抗氧化作用以及抑制炎癥等作用。臨床上對(duì)慢性肝病伴肝內(nèi)膽汁淤積、原發(fā)性膽汁性肝硬化等疾病具有顯著的療效。 有研究表明LIDCA可能還具有抗肝纖維化的作用。為了進(jìn)一步探討其對(duì)肝纖維化的影響，本實(shí)驗(yàn)采用了經(jīng)典的實(shí)

3、驗(yàn)性肝纖維化的動(dòng)物造模方法——豬血清誘發(fā)肝纖維化，并選擇秋水仙堿作為治療參照藥物，觀察UDCA在動(dòng)物整體環(huán)境下阻抑免疫損傷性肝纖維化的療效：進(jìn)一步研究LJDCA對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖和Ⅰ型膠原分泌的影響以及UDCA對(duì)TGFβ1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，探討UDCA阻抑肝纖維化的可能分子機(jī)理，為臨床上防治肝纖維化提供初步的基礎(chǔ)理論與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1．Wister大鼠120只，雌雄各半，隨機(jī)分成6組：肝

4、纖維化模型組(B組)20只，給予豬血清腹腔注射，0.5ml/次，每周2次，持續(xù)12周，誘導(dǎo)大鼠肝纖維化；正常對(duì)照組(A組)20只，給予等量生理鹽水腹腔注射；13DCA大中小劑量組(C、D、E組)各20只，豬血清處理同模型組，同時(shí)將LJDCA(30mg·kg<'-1>·<'-1>、15mg·kg<'-1>·d,<'-1>、7.5mg·kg<'-1>·d<'-1>)用普通飲用水配至成8g/L、4g/L、2g/L的濃度，給大鼠自由飲用，持續(xù)1

5、2周；秋水仙堿組(F組)20只，豬血清處理同模型組，同時(shí)將秋水仙堿(0.1mg·kg<'-1>·d<'-1>)用普通飲用水配成秋水仙堿水溶液，給大鼠自由飲用，持續(xù)12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱重后處死全部大鼠，剖開(kāi)腹壁，觀察大鼠肝臟和脾臟情況；采用HE染色法和Massorl染色法觀察大鼠肝組織病理形態(tài)改變及纖維化程度分級(jí)；隨機(jī)抽取樣本電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)改變；用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、T-谷氨

6、酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽汁酸(TBA)和白蛋白(Alb)指標(biāo)；采用放射免疫分析法檢測(cè)血清透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(C Ⅳ)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)；采用免疫組化法檢測(cè)大鼠肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF β1表達(dá)，并用圖像分析半定量法檢測(cè)其平均灰度值；逆轉(zhuǎn)錄——聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)肝組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TGF β lmRNA的表達(dá)，并用圖像分析法計(jì)算其曲線下峰面積與GAPDHmRNA積分值之比值。

7、2．用不同劑量(0.25、0.5、1．Ommol/L)的UDCA處理經(jīng)5ng/ml TGFβ1誘導(dǎo)的HSC-T6 24h及48h。MTT比色法檢測(cè)UDCA對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響：流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期分布；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各組細(xì)胞Ⅰ型膠原、cyclinD，cyclinE蛋白的表達(dá)；RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)。 3．用不同劑量(0.25、0.5、1．Ommol/L)的UDCA處理經(jīng)5ng

8、/ml TGFβ1誘導(dǎo)的HSC-T6 24h及48h。以蛋白印跡法觀察UDCA對(duì)TGFβ1Ⅰ型受體(TβR Ⅰ)、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)的影響；RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞Smad3、Smad7、CBPmRNA的表達(dá)。 結(jié)果：1．UDCA各劑量組大鼠體重較模型組明顯增加(P<0.05～0.01)，肝重和脾重均較模型組明顯減輕(P<0.05～0.01)；UDCA各劑量組肝纖維化病理分級(jí)較模型組明顯改善(P<0.0

9、5～0.01)：UDCA各劑量組大鼠血清ALT、AST、GGT活性和TBA水平較模型組明顯降低(P<0.05～0.01)，UDCA大劑量組血清Alb含量較模型組明顯升高(P<0.05)：UDCA各劑量組大鼠血清中HA、LN、C IV和PCⅢ水平較模型組明顯下降(均P<0.01)；UDCA各劑量組大鼠肝組織Ⅰ型膠原及其mRNA表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.05～0.01)，而且呈劑量依賴關(guān)系；Ⅲ型膠原及其mRNA表達(dá)較模型組明顯降低(P<

10、0.05～0.01)；UDCA大劑量組大鼠肝組織TGFβ 1mRNA表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.05)，但其TGFβ1蛋白表達(dá)與模型組比較無(wú)差異(P>0.05)；電鏡顯示UDCA各劑量組大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)較模型組顯著改善。 2.UDCA對(duì)TGF β 1誘導(dǎo)HSC增殖有明顯的抑制作用，而且這種作用呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系；UDCA使HSC G<,0>/G<,1>期細(xì)胞明顯升高(P<0.05～0.01)，對(duì)HSC細(xì)胞周期有明顯的阻滯作

11、用，而且這種作用呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系；UDCA顯著抑制I型膠原及其mRNA表達(dá)(P<0.05～0.01)，而且這種作用呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系；大劑量UDCA可顯著抑制cyclinD<,1>、cyclinE蛋白表達(dá)(P<0.05)。 3.經(jīng)外源性TGF β 1誘導(dǎo)后，大鼠肝HSC T β R I、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.05～0.01)，Smad3、Smad7、CBPmRNA表達(dá)亦顯著增加(P<

12、0.05～0.01)；LIDCA對(duì)TGF β 1誘導(dǎo)HSC T β R I蛋白表達(dá)及Smad4蛋白表達(dá)無(wú)影響(P>0.05)；UDCA能夠顯著減少TGF β 1誘導(dǎo)HSC Smad3蛋白及其mRNA表達(dá)(P<0.05～0.01)，而且這種作用呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系；顯著減少CBPmRNA表達(dá)(P<0.05～0.01)，而且這種作用呈劑量依賴關(guān)系；顯著增加Smad7蛋白及其mRNA表達(dá)(P<0.05～0.01)。 結(jié)論：1.UDCA

13、可顯著增加免疫損傷性肝纖維大鼠體重，降低大鼠肝重和脾重；顯著改善大鼠肝纖維化病理程度；顯著降低大鼠血清ALT、AST、GGT、TBA，升高Alb，保護(hù)肝細(xì)胞，改善肝功能；顯著降低大鼠血清透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(C IV)和Ⅲ型前膠原(PCⅢ)水平，從而減輕肝纖維化；顯著抑制大鼠肝組織Ⅰ型膠原表達(dá)，而且呈劑量依賴關(guān)系；顯著抑制大鼠肝組織Ⅲ型膠原表達(dá)；大劑量UDCA能顯著抑制大鼠肝組織肝纖維化細(xì)胞因子TGF β lm

14、RNA表達(dá)，在一定程度上阻抑肝纖維化的發(fā)展。 2.UDCA對(duì)TGF β 1誘導(dǎo)HSC細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用，其抑制作用呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系；UDCA對(duì)HSC細(xì)胞周期有明顯的阻滯作用，而且這種作用呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系；顯著抑制I型膠原分泌，呈劑量、時(shí)間依賴關(guān)系；大劑量UDCA對(duì)cyclinD<,1>、cyclinE蛋白有顯著的抑制作用。 3.LIDCA對(duì)TGF β 1誘導(dǎo)HSC T β R I蛋白及Smad4蛋白表達(dá)無(wú)影