人多態(tài)性CYP2C19的酶動力學(xué)分析及在藥物篩選應(yīng)用中的初步研究.pdf

1、人細胞色素2C19作為細胞色素P450家族中重要的一員在許多藥物的代謝過程中發(fā)揮著重要的作用，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，其基因的多態(tài)性是導(dǎo)致個體、種族間的藥物代謝差異和藥物不良反應(yīng)的決定因素。本研究利用體外重組技術(shù)，克隆及表達CYP2C19野生株及有代表性的10個單核苷酸突變株(它們分別代表在人體內(nèi)天然存在的多態(tài)性等位基因，同時這些突變不包括同義突變，在調(diào)控區(qū)的突變和引起蛋白缺失的突變)，建立了一個研究CYP2C19多態(tài)性酶的平臺。通過對這些多態(tài)性等

2、位基因進行酶動力學(xué)分析和藥物抑制高通量篩選，測定酶動力學(xué)常數(shù)和藥物抑制常數(shù)，所得數(shù)據(jù)可為研究多態(tài)性等位基因在藥物代謝中的作用和在新藥開發(fā)早期進行新藥評價提供重要的信息。 通過RT-PCR法從人肝組織中獲得CYP2C19野生型的cDNA(1.5Kb)，并將之克隆到酵母表達載體pYES2/CT上，并通過PCR定點突變的方法在野生型CYP2C19基因中引入單核苷酸突變，得到10個SNPs(L17P，E92D；W120R，R132Q，R

3、144H，R150H，P227L，1331V，R410C，和R433W)，通過測序得以證實；將11個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入已經(jīng)整合了細胞色素P450氧化還原酶基因(POR)的釀酒酵母中，半乳糖誘導(dǎo)表達目的蛋白，利用SDS-PAGE和Western Blot分析表達產(chǎn)物，結(jié)果表明11個菌株均得到表達，所得蛋白約為55Kda，與預(yù)期大小相同。大量誘導(dǎo)高表達菌株并制備微粒體蛋白S9部分，將所制備的微粒體用CO還原示差光譜法進行P450含量測定，只有

4、WT、1331V、 R150H在450nm處有吸收峰，含量分別為22 pmol/mg、16 pmol/mg、15pmol/mg；其它SNPs只有在420nm處有非常明顯的吸收峰。 用適量微粒體蛋白與2C19特異性熒光底物CEC進行酶學(xué)反應(yīng)，所得數(shù)據(jù)用非線性回歸分析法計算出Km值、Vmax值和內(nèi)在清除率CLint值(Vmax/Km)，結(jié)果表明：在10個突變株中，除了R132Q和R433W完全喪失酶活性外，其余有活性的不同的多態(tài)性等

5、位基因之間的Km值相差不大，但是Vmax差別很大，其中1331V、R410C與野生株比較接近，其余突變株的Vmax值均有顯著降低。將低物濃度固定，與系列濃度的抑制劑共同孵育，用熒光檢測技術(shù)測定已知抑制劑對重組CYP2C19野生型酶的抑制常數(shù)，結(jié)果表明：CYP2C19特異性抑制劑反苯環(huán)丙胺對重組CYP2C19野生型酶有特異性抑制，IC50約為7.3μM，與相關(guān)報道數(shù)據(jù)接近，而CYP2C9特異性抑制劑磺胺苯吡唑?qū)YP2C19無抑制。

6、 運用熒光高通量檢測技術(shù)對9種有活性的多態(tài)性等位酶和9類20種藥物的抑制篩選實驗表明：2C19所代謝的底物和已知抑制劑均對其有抑制，8種藥物如他汀類藥物、噻唑烷二酮類藥物等對CYP2C19無抑制；化學(xué)結(jié)構(gòu)或治療作用類似的同類藥品對CYP2C19的抑制情況不一；不同基因型被同一種藥物抑制程度也不盡相同，甚至差別較大。 本研究首次成功構(gòu)建了11個CYP2C19多態(tài)性等位基因的釀酒酵母表達體系，所誘導(dǎo)制備的酵母微粒體蛋白活性良好而穩(wěn)