生長因子基因活化基質材料在促進自體韌帶移植愈合中的體內外應用研究.pdf

1、第一部分：血小板衍化生長因子基因活化材料的制備及生物活性檢測
　　 目的：構建含有人血小板衍化生長因子-B(hPDGF-B)基因片段的真核表達質粒，并利用兔成纖維細胞做生物活性檢測。
　　 方法：應用基因重組技術和限制性內切酶雙酶切構建并鑒定EGFP-N1-hPDGF-B真核表達載體，體外培養(yǎng)兔成纖維細胞，傳代培養(yǎng)后用陽離子脂質體(LipofectAMINE)：EGFP-N1-hPDGF-B為3μL∶1μg的比例轉染，G

2、418篩選獲得穩(wěn)定轉染的細胞。通過RT-PCR和熒光法檢測PDGF-B表達水平；利用四甲基偶氮唑法檢測PDGF-B的生物學活性繪制成纖維細胞生長曲線。
　　 結果：成功構建含EGFP-N1-PDGF-B基因的真核表達載體，經RT-PCR檢測了PDGF-B在轉錄水平mRNA的表達情況，熒光法檢測目標基因成功轉染至靶細胞，轉染后的成纖維細胞呈強陽性表達，并持續(xù)4周以上。
　　 結論：重組真核表達載體構建正確，并能在成纖維細胞

3、中表達PDGF-B mRNA，PDGF-B基因轉染可使成纖維細胞有效而穩(wěn)定的表達活性PDGF-B而產生生物效應。對成纖維細胞有明顯的促進生長作用。
　　 第二部分：血小板衍化生長因子基因活化材料在體實驗研究的組織學分析
　　 目的：利用光鏡和透射電鏡等組織形態(tài)學觀察手段，比較實驗組與對照組在重建愈合過程中膠原表達情況和重建細胞顯微結構的差異，以評價脂質體與攜帶血小板衍化生長因子基因片段的合成質粒共同構成的基因轉染系統(tǒng)在兔

4、前交叉韌帶重建動物模型中對移植物愈合的促進作用。
　　 方法：成年新西蘭兔48只，隨機分為實驗組和對照組。取半腱肌肌腱替代前交叉韌帶制備重建動物模型，實驗組在重建部位給予基因轉染材料，對照組給予鹽水。術后1個月，3個月和6個月，取出重建前交叉韌帶標本，對其進行光學顯微鏡和電鏡觀察，比較膠原表達和細胞超微結構的變化。
　　 結果：光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在不同時期，實驗組的成纖維細胞數(shù)量、膠原含量、膠原纖維的直徑以及膠原纖維的排列

5、均好于對照組，實驗組標本組織形態(tài)在6月時已十分接近正常前交叉韌帶組織結構。電鏡觀察見各時期實驗組的細胞增生現(xiàn)象比對照組活躍，提示修復細胞代謝更旺盛，纖維間隙內有較多基質成分，胞質中可見較為豐富的內質網結構和線粒體。
　　 結論：PDGF生長因子基因轉染的重建韌帶組織結構愈合好于對照組，提示以脂質體為載體攜帶PDGF-B基因的質粒在重建前交叉韌帶愈合局部具有良好的原位轉染生物學效能。具有一定的實際應用前景。
　　 第三部分

6、血小板衍化生長因子基因活化材料在體實驗生物力學測試
　　 目的：觀察脂質體-PDGF-B基因轉染系統(tǒng)對兔半腱肌肌腱替代前交叉韌帶動物模型中重建韌帶愈合強度的促進作用。
　　 方法：成年新西蘭兔48只，隨機分為實驗組和對照組。取半腱肌肌腱替代前交叉韌帶制備重建動物模型，實驗組在重建部位給予基因轉染材料，對照組給予鹽水。術后1個月，3個月和6個月，取出重建前交叉韌帶標本，對其作生物力學測試，記錄最大斷裂負荷(極限負荷)、斷裂

7、時最大拉伸位移，應力、應變及剛度，并作出以上數(shù)據(jù)隨時間變化的關系圖譜。
　　 結果：
　　 1.實驗標本大體觀察無異常，對照組重建韌帶斷裂1例，實驗組未發(fā)現(xiàn)重建韌帶斷裂，動物模型重建手術總體成功率為97.9％。
　　 2.術后1個月時，兩組標本的各項力學指標無顯著性差異。術后第3月和第6月時，實驗組重建韌帶的最大斷裂負荷和彈性模量兩項性能顯著大于對照組，p≤0.05，但兩組的其它力學指標無顯著性差異。