重組人血小板生成因子對(duì)骨髓抑制的小鼠和獼猴及輻射后MO7e細(xì)胞保護(hù)作用的研究.pdf

1、血小板生成因子(TPO)是一個(gè)非常重要的造血調(diào)控因子。經(jīng)過(guò)幾十年的不懈努力，基本上闡明了血小板生成因子及其受體系統(tǒng)(TPO/c-Mpl)在造血調(diào)控方面的作用，并在此基礎(chǔ)上，研制了重組人血小板生成因子(rhTPO)，以治療放療和化療等引起的血小板減少癥。研究表明TPO是促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖、分化、成熟以及血小板產(chǎn)生的最基本的調(diào)控因子。此外，TPO可單獨(dú)作用于原始造血干細(xì)胞和巨核細(xì)胞潛能的造血祖細(xì)胞，保護(hù)其生長(zhǎng)，擴(kuò)增其數(shù)量，并可與干細(xì)胞生長(zhǎng)因子

2、(SCF)、白介素11(IL-11)和紅細(xì)胞生成素(EPO)等其它造血生長(zhǎng)因子協(xié)同作用于造血祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖。 本試驗(yàn)首先觀察了國(guó)產(chǎn)重組人血小板生成因子(rhTPO)對(duì)輻射引起的C57小鼠骨髓抑制的治療作用；然后觀察了rhTPO對(duì)用環(huán)磷酰胺后獼猴的骨髓有核細(xì)胞增生情況的影響；并進(jìn)一步利用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和透射電鏡等方法研究rhTPO對(duì)輻射所致MO7e細(xì)胞凋亡的影響來(lái)探討其調(diào)控造血系統(tǒng)的可能的機(jī)制。 一．rhTPO對(duì)

3、輻射所致C57小鼠骨髓抑制的影響 雄性C57小鼠75只，經(jīng)塢<'137>銫γ射線4 Gy單次全身輻射，造成骨髓抑制。于輻射前及輻射后不同時(shí)間采血，測(cè)定血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白量。根據(jù)輻射前血小板計(jì)數(shù)分層，小鼠隨機(jī)分成5組：溶媒對(duì)照組，rhIL-11組，rhTPO低、中、高劑量組。在全身輻射后第5天開(kāi)始，分別皮下注射給予檸檬酸緩沖液，rhIL-11 150 μg·kg<'-1>， rhTPO 4.5， 9和18μg·kg<

4、'-1>，每天給藥1次(rhIL-11分兩次給藥)，連續(xù)給藥22天，給藥容積為10 mL·kg<'-1>。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱體重，頸椎脫臼處死小鼠，取脾臟和一側(cè)股骨，稱脾臟重量，計(jì)算脾重/體重比，并用紫外分光光度法測(cè)定骨髓DNA含量。結(jié)果顯示給藥第8天開(kāi)始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(給藥第22天)，rhIL-11組， rhTPO 4.5， 9和18μg·kg<'-1>組小鼠血小板計(jì)數(shù)增加幅度明顯大于對(duì)照組(P<0.01)；其中，rhTPO 9和18μg·kg

5、<'-1>組的增幅較rhTPO4.5μg·kg<'-1>和rhIL-11組大(P<0.01)。在給藥第22天，rhTPO 18μg·kg<'-1>組的增幅較rhTPO 9μg·kg<'-1>組大(P<0.01)。給藥第15和22天，IL-11組小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加幅度明顯大于對(duì)照組(P<0.01)，而rhTPO 4.5和9μg·kg<'-1>組小鼠在給藥第22天時(shí)其白細(xì)胞計(jì)數(shù)的增幅才比對(duì)照組明顯增加(P<0.01，P<0.05)。rhTP

6、O 4.5，9和18μg·kg<'-1>組小鼠脾臟重量和脾重/體重比與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。rhTPO 9μg·kg<'-1>組小鼠骨髓DNA含量比對(duì)照組明顯增加(P<0.05)。 二．rhTPO對(duì)用環(huán)磷酰胺后獼猴骨髓細(xì)胞的影響 獼猴20只，靜脈注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，每天1次，連續(xù)2天，造成骨髓抑制。隨機(jī)分成4組：溶媒對(duì)照組，rhIL-11組，rhTPO低和高劑量組。用環(huán)磷酰胺后第3天開(kāi)始，分別皮

7、下注射給予檸檬酸緩沖液，rhIL-11 62.5μg·kg<'-1>，rhTPO 3和9CC，每天給藥1次，連續(xù)給藥20天，給藥容積為0.1 mL·kg<'-1>。給藥第22天肌內(nèi)注射氯胺酮麻醉動(dòng)物，無(wú)菌條件下抽取骨髓，做骨髓涂片，常規(guī)瑞氏染色，進(jìn)行分類，拍照。骨髓涂片顯示rhIL-11組，rhTPO低和高劑量組獼猴骨髓象中粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞三系增生均活躍，巨核細(xì)胞數(shù)量增多，以成熟型為主，血小板成堆多見(jiàn)，rhTPO的作用強(qiáng)度與其劑

8、量相關(guān)。 三．rhTPO對(duì)輻射引起MO7e細(xì)胞凋亡的影響 1．rhTPO對(duì)輻射后MO7e細(xì)胞存活率的影響： MO7e細(xì)胞經(jīng)<'137>銫γ射線5 Gy輻射造模后，隨機(jī)分成5組，分別與培養(yǎng)液，GM-CSF(10 μg/L)和rhTPO(1，10，μg/L)共同孵育0、24、48和72 h，通過(guò)MTT法測(cè)定OD值，計(jì)算MO7e細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示輻射后24和48 h，rhTPO 10，100μg/L組和GM-CSF

9、組細(xì)胞存活率均明顯高于輻射對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)，輻射后72 h，rhTPO 100μg/L組細(xì)胞存活率仍明顯高于輻射對(duì)照組(P<0.01)。其中rhTPO 100μg/L組在輻射后24，48和72 h的細(xì)胞存活率顯著高于rhTPO 10μg/L組(P<0.01，P<0.05)；在輻射后48和72 h的細(xì)胞存活率也明顯高于GM-CSF組(P<0.01，P<0.05)。 2．rhTPO對(duì)輻射后MO7e細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞

10、周期分布的影響： 另取MO7e細(xì)胞，經(jīng)<'137>銫γ射線5 Gy輻射造模后，隨機(jī)分成4組，分別與培養(yǎng)液，GM-CSF(10μg/L)和rhTPO(10，100μg/L)共同孵育24、36和48 h，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布；透射電鏡觀察MO7e細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示輻射后36 h，rhTPO 10，100μg/L組和GM-CSF組細(xì)胞凋亡率均較輻射對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，并且rhTPO 100

11、μg/L組比rhTPO 10μg/L組效果更明顯(P<0.01)。輻射后36 h，與正常培養(yǎng)的細(xì)胞相比，輻射對(duì)照組處于G<,0>/G<,1>期細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)，G<,2>/M期、S期的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05，P<0.01)；而GM-CSF組和rhTPO 100μg/L組處于G<,0>/G<,1>期細(xì)胞數(shù)均較輻射對(duì)照組顯著減少(P<0.01)，GM-CSF組和rhTPO 100μg/L組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)

12、。輻射后24 h，MO7e細(xì)胞呈現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化，表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮??；表面微絨毛消失；核染色質(zhì)固縮聚集于核膜周邊，呈不規(guī)則塊狀或新月?tīng)?；但?xì)胞膜和細(xì)胞器均完整。 上述結(jié)果提示皮下注射給予rhTPO 4.5，9和18μg·kg<'-1>，能劑量依賴性升高輻射后C57小鼠的外周血小板數(shù)目，促進(jìn)輻射后C57小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)的恢復(fù)，增加輻射后C57小鼠骨髓DNA含量。它升高血小板作用比rhIL-11強(qiáng)而起效快；升高白細(xì)胞作用比rh