血小板第4因子對(duì)人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的輻射保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：電離輻射（ionizing radiation,IR）后組織器官修復(fù)主要取決于干細(xì)胞的增殖能力。無論是來自表皮還是血液的干細(xì)胞都聚集于造血微環(huán)境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)內(nèi)，通過HIM遷移到遠(yuǎn)處發(fā)揮作用。HIM中的基質(zhì)細(xì)胞不僅對(duì)維持干細(xì)胞增殖能力有利，還能保持其旁觀者效應(yīng)，使得絕大多數(shù)造血干細(xì)胞維持在非細(xì)胞周期增殖狀態(tài)，從而避免了電離輻射直接誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

2、和其產(chǎn)生細(xì)胞因子、自由基等所致的間接殺傷。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是HIM的重要組成成分。它通過與造血細(xì)胞密切接觸、分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)和多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)造血，其結(jié)構(gòu)和功能的完整對(duì)于保持機(jī)體在生理狀態(tài)尤其是應(yīng)激狀態(tài)下造血穩(wěn)定具有十分重要的作用。血小板第4因子（platelet factor 4,PF4）是一個(gè)潛在的輻射保護(hù)趨化因子，它能可

3、逆性的抑制造血干/祖細(xì)胞增殖、促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)的黏附和活性、在干細(xì)胞移植中促進(jìn)循環(huán)干細(xì)胞歸巢到骨髓、減弱骨髓細(xì)胞對(duì)化療藥的化學(xué)敏感性并提高化療后造血祖細(xì)胞的活力和生存率、加速全身照射后小鼠造血恢復(fù)、抑制輻射所致小鼠骨髓細(xì)胞的凋亡、保護(hù)小鼠造血細(xì)胞免受輻射損傷。
　　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：本課題研究了PF4對(duì)急性輻射損傷的人骨髓基質(zhì)細(xì)胞（human bone marrow stromal cells，hBMSCs）的保護(hù)

4、作用，旨在探討PF4的輻射防護(hù)機(jī)制，為尋找可應(yīng)用于臨床的新型輻射保護(hù)劑奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)將原代培養(yǎng)的hBMSCs隨機(jī)分為4組：PF4+①照射組（P+I），PF4②保護(hù)組（P），③單純照射組（Ⅰ），④正常對(duì)照組（N）。照射前給予1μg·ml-1PF4或等量PBS預(yù)孵育12h，然后予以或不予以5.0Gy吸收劑量的60Co-γ射線均勻照射，輻照后設(shè)置時(shí)間點(diǎn)收集各組細(xì)胞進(jìn)行研究，具體為：1、甲基噻唑基四唑法（methyl thiazolyl tet

5、razolium,MTT）測(cè)定照后d0～d10細(xì)胞活性以確定PF4最佳給藥時(shí)間和最佳起效劑量以及最佳電離輻射吸收劑量；2、熒光共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察各處理組細(xì)胞的生長狀態(tài)、生長規(guī)律和表觀特性；3、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)輻照后20h細(xì)胞周期；4、磷脂酰絲氨酸外翻分析法檢測(cè)輻照后d2、d4、d6細(xì)胞凋亡；5、實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法（realtime reverse transcription polymerase chain reaction,RT

6、-PCR）測(cè)定輻照后20hp21、CYP1A1、PCNAmRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1、PF4對(duì)人正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長無明顯抑制或促進(jìn)作用。2、與I組相比，PF4明顯提高5.0Gy60Co-γ射線照射后hBMSCs存活率，存活細(xì)胞達(dá)60％以上（I組＜40％）。3、受輻照組細(xì)胞增殖緩慢，約于照后d4進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，與I組比較，P+I組細(xì)胞體積大、邊界清、輪廓完整、胞內(nèi)分泌顆粒相對(duì)較少、碎裂細(xì)胞少、呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞特有的紡錘形、條索狀、

7、漩渦樣排列，同時(shí)細(xì)胞存活時(shí)間（2.5個(gè)月）和傳代次數(shù)（4～5）明顯增加，I組僅為1.5個(gè)月和1～2次。4、I組G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于N組和P組，相差約（20～40）％；與N組和I組相比，使用PF4的實(shí)驗(yàn)組S期比例顯著增高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；P組與P+I組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5、細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，輻照因素對(duì)hBMSCs的影響從第2天已開始，活細(xì)胞減少（91.500±0.819％）、晚期凋亡細(xì)胞增多（3.567±0.551％）

8、，后期早期凋亡細(xì)胞（17.133±2.854％）異常增多；PF4對(duì)hBMSCs的保護(hù)作用在輻照早期不甚明顯，僅早期凋亡細(xì)胞減少（2.233±0.208％）、活細(xì)胞增多（93.033±0.379％），從第4天以后該優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)得更為明顯（P＜0.001），到第6天時(shí)P+I組的各組細(xì)胞與N組和P組相差無異，而單純照射組細(xì)胞損傷巨大。4、realtimeRT-PCR結(jié)果顯示，照射引起hBMSCsp21mRNA表達(dá)上調(diào)，I組（+0.84±0.03）

9、p21mRNA表達(dá)較之N組（0.000±0.000）顯著上調(diào)（P＜0.01）；與I組相比，P組（+0.170±0.090）p21mRNA表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；P+I（+0.420±0.210）組較之I組p21mRNA表達(dá)下調(diào)；其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PF4能誘導(dǎo)CYP1A1mRNA表達(dá)下調(diào)，與I組（+0.201±0.091）相比，P組（﹣0.221±0.084）和P+I組（﹣0.502±0.060）CYP1A1mRNA表達(dá)明顯下

10、調(diào)（P＜0.01）；當(dāng)有照射因素參與時(shí)，含PF4的實(shí)驗(yàn)組hBMSCsCYP1A1mRNA表達(dá)的下調(diào)更顯著。
　　結(jié)論：1、60Co-γ射線造成hBMSCs細(xì)胞損傷的最佳吸收劑量為5.0Gy；PF4對(duì)hBMSCs的最佳給藥時(shí)間為照射前12h，最佳起效劑量為1μg·ml-1。2、PF4對(duì)人正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞生長無明顯抑制或促進(jìn)作用。3、PF4具有減輕電離輻射對(duì)hBMSCs損傷的保護(hù)作用，該作用呈現(xiàn)出劑量依賴性和可逆性，無時(shí)間依賴性，具體