血小板第4因子對人骨髓基質(zhì)細胞的輻射保護作用及機制研究.pdf

1、研究背景和目的：電離輻射（ionizing radiation,IR）后組織器官修復主要取決于干細胞的增殖能力。無論是來自表皮還是血液的干細胞都聚集于造血微環(huán)境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)內(nèi)，通過HIM遷移到遠處發(fā)揮作用。HIM中的基質(zhì)細胞不僅對維持干細胞增殖能力有利，還能保持其旁觀者效應，使得絕大多數(shù)造血干細胞維持在非細胞周期增殖狀態(tài)，從而避免了電離輻射直接誘導的細胞凋亡

2、和其產(chǎn)生細胞因子、自由基等所致的間接殺傷。骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是HIM的重要組成成分。它通過與造血細胞密切接觸、分泌細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)和多種細胞因子調(diào)節(jié)造血，其結(jié)構(gòu)和功能的完整對于保持機體在生理狀態(tài)尤其是應激狀態(tài)下造血穩(wěn)定具有十分重要的作用。血小板第4因子（platelet factor 4,PF4）是一個潛在的輻射保護趨化因子，它能可

3、逆性的抑制造血干/祖細胞增殖、促進造血干/祖細胞與內(nèi)皮細胞和間質(zhì)的黏附和活性、在干細胞移植中促進循環(huán)干細胞歸巢到骨髓、減弱骨髓細胞對化療藥的化學敏感性并提高化療后造血祖細胞的活力和生存率、加速全身照射后小鼠造血恢復、抑制輻射所致小鼠骨髓細胞的凋亡、保護小鼠造血細胞免受輻射損傷。
　　實驗方法和結(jié)果：本課題研究了PF4對急性輻射損傷的人骨髓基質(zhì)細胞（human bone marrow stromal cells，hBMSCs）的保護

4、作用，旨在探討PF4的輻射防護機制，為尋找可應用于臨床的新型輻射保護劑奠定基礎。實驗將原代培養(yǎng)的hBMSCs隨機分為4組：PF4+①照射組（P+I），PF4②保護組（P），③單純照射組（Ⅰ），④正常對照組（N）。照射前給予1μg·ml-1PF4或等量PBS預孵育12h，然后予以或不予以5.0Gy吸收劑量的60Co-γ射線均勻照射，輻照后設置時間點收集各組細胞進行研究，具體為：1、甲基噻唑基四唑法（methyl thiazolyl tet

5、razolium,MTT）測定照后d0～d10細胞活性以確定PF4最佳給藥時間和最佳起效劑量以及最佳電離輻射吸收劑量；2、熒光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察各處理組細胞的生長狀態(tài)、生長規(guī)律和表觀特性；3、流式細胞術檢測輻照后20h細胞周期；4、磷脂酰絲氨酸外翻分析法檢測輻照后d2、d4、d6細胞凋亡；5、實時逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應法（realtime reverse transcription polymerase chain reaction,RT

6、-PCR）測定輻照后20hp21、CYP1A1、PCNAmRNA表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1、PF4對人正常骨髓基質(zhì)細胞生長無明顯抑制或促進作用。2、與I組相比，PF4明顯提高5.0Gy60Co-γ射線照射后hBMSCs存活率，存活細胞達60％以上（I組＜40％）。3、受輻照組細胞增殖緩慢，約于照后d4進入對數(shù)生長期，與I組比較，P+I組細胞體積大、邊界清、輪廓完整、胞內(nèi)分泌顆粒相對較少、碎裂細胞少、呈現(xiàn)典型的成纖維細胞特有的紡錘形、條索狀、

7、漩渦樣排列，同時細胞存活時間（2.5個月）和傳代次數(shù)（4～5）明顯增加，I組僅為1.5個月和1～2次。4、I組G0/G1期細胞比例顯著高于N組和P組，相差約（20～40）％；與N組和I組相比，使用PF4的實驗組S期比例顯著增高有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；P組與P+I組相比無統(tǒng)計學差異。5、細胞凋亡結(jié)果顯示，輻照因素對hBMSCs的影響從第2天已開始，活細胞減少（91.500±0.819％）、晚期凋亡細胞增多（3.567±0.551％）

8、，后期早期凋亡細胞（17.133±2.854％）異常增多；PF4對hBMSCs的保護作用在輻照早期不甚明顯，僅早期凋亡細胞減少（2.233±0.208％）、活細胞增多（93.033±0.379％），從第4天以后該優(yōu)勢表現(xiàn)得更為明顯（P＜0.001），到第6天時P+I組的各組細胞與N組和P組相差無異，而單純照射組細胞損傷巨大。4、realtimeRT-PCR結(jié)果顯示，照射引起hBMSCsp21mRNA表達上調(diào)，I組（+0.84±0.03）

9、p21mRNA表達較之N組（0.000±0.000）顯著上調(diào)（P＜0.01）；與I組相比，P組（+0.170±0.090）p21mRNA表達下調(diào)（P＜0.05）；P+I（+0.420±0.210）組較之I組p21mRNA表達下調(diào)；其余各組間差異無統(tǒng)計學意義。PF4能誘導CYP1A1mRNA表達下調(diào)，與I組（+0.201±0.091）相比，P組（﹣0.221±0.084）和P+I組（﹣0.502±0.060）CYP1A1mRNA表達明顯下

10、調(diào)（P＜0.01）；當有照射因素參與時，含PF4的實驗組hBMSCsCYP1A1mRNA表達的下調(diào)更顯著。
　　結(jié)論：1、60Co-γ射線造成hBMSCs細胞損傷的最佳吸收劑量為5.0Gy；PF4對hBMSCs的最佳給藥時間為照射前12h，最佳起效劑量為1μg·ml-1。2、PF4對人正常骨髓基質(zhì)細胞生長無明顯抑制或促進作用。3、PF4具有減輕電離輻射對hBMSCs損傷的保護作用，該作用呈現(xiàn)出劑量依賴性和可逆性，無時間依賴性，具體