小腦間位核調(diào)節(jié)免疫功能的作用途徑研究.pdf

1、第一部分小腦間位核—下丘腦谷氨酸能神經(jīng)投射傳遞小腦的免疫調(diào)節(jié)信息
　　 目的：
　　 我們實(shí)驗(yàn)室以往的研究表明小腦間位核可調(diào)節(jié)免疫功能。由于小腦與免疫系統(tǒng)之間沒有直接的結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，因此闡明小腦調(diào)節(jié)免疫功能的信息傳遞途徑對(duì)于更好地理解小腦的免疫調(diào)節(jié)功能具有重要作用。本研究以小腦一下丘腦的神經(jīng)投射為切入點(diǎn)來(lái)揭示其在傳遞小腦免疫調(diào)節(jié)信息中的作用，為小腦神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)提供新的資料，有助于拓寬小腦功能的知識(shí)，促進(jìn)臨床上對(duì)小腦神經(jīng)免

2、疫調(diào)節(jié)異常疾病的思考和研究。
　　 方法：
　　 1．在一側(cè)小腦間位核內(nèi)微量注射順行神經(jīng)束路追蹤劑葡聚糖-德克薩斯紅（dextran-texas red，dextran-TR），觀察小腦間位核至下丘腦神經(jīng)投射的路徑及終止部位。
　　 2．在一側(cè)下丘腦外側(cè)區(qū)（順行追蹤顯示下丘腦內(nèi)終止纖維最豐富的區(qū)域）微量注射逆行神經(jīng)束路追蹤劑紅色熒光金（fluoro-ruby,FR），觀察小腦間位核內(nèi)FR逆行標(biāo)記的神經(jīng)元，同時(shí)，結(jié)

3、合谷氨酸熒光免疫組織化學(xué)法探討小腦問位核投射至下丘腦的神經(jīng)元中是否存在谷氨酸能神經(jīng)元。
　　 3．在雙側(cè)小腦間位核內(nèi)微量注射谷氨酰胺酶抑制劑6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（6-diazo-5-oxo-L-norleucine，DON），以抑制間位核內(nèi)谷氨酸能神經(jīng)元合成谷氨酸，并以雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射等量生理鹽水及未經(jīng)任何處理的動(dòng)物作為對(duì)照。在上述三組（未處理對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組、DON組）大鼠的單側(cè)下丘腦外側(cè)區(qū)微量注射逆行神

4、經(jīng)束路追蹤劑FR,5天后，在雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射DON或生理鹽水,3天后，同一層面的間位核腦片應(yīng)用谷氨酸熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)，觀察小腦間位核—下丘腦外側(cè)區(qū)谷氨酸能神經(jīng)投射的數(shù)量變化。
　　 4．在雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射DON后第3天，用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）測(cè)定下丘腦內(nèi)谷氨酸含量的變化。
　　 5．在雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射DON后第3天，用血細(xì)

5、胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)動(dòng)物外周血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞百分比的變化；用羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxy fluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE）和結(jié)合PE的抗大鼠CD3抗體雙標(biāo)腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞對(duì)刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)刺激的增殖能力的變化；用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELI

6、SA）檢測(cè)血清中抗綿羊紅細(xì)胞IgM抗體水平的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1．小腦間位核內(nèi)微量注射dextran-TR后示蹤可見間位核神經(jīng)元發(fā)出離核纖維，行走于同側(cè)小腦上腳中，經(jīng)小腦上腳交叉到達(dá)對(duì)側(cè)，然后繼續(xù)走行于小腦上腳中，進(jìn)入下丘腦后較多纖維終止于下丘腦外側(cè)區(qū)，少數(shù)纖維終止于下丘腦室旁核和下丘腦后區(qū)。說(shuō)明小腦間位核神經(jīng)元發(fā)出纖維直接投射至下丘腦（主要是外側(cè)區(qū)）。
　　 2．下丘腦外側(cè)區(qū)內(nèi)微量注射FR后可逆行追蹤

7、到對(duì)側(cè)小腦間位核具有FR標(biāo)記的神經(jīng)元，這進(jìn)一步證明了小腦間位核與下丘腦之間存在直接的神經(jīng)投射；利用谷氨酸熒光免疫組織化學(xué)法染色小腦間位核，發(fā)現(xiàn)這些FR標(biāo)記的神經(jīng)元中有許多谷氨酸陽(yáng)性神經(jīng)元。表明小腦間位核投射至下丘腦外側(cè)區(qū)的神經(jīng)纖維中有谷氨酸能神經(jīng)。
　　 3．雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射DON(50mM)后第3天，間位核內(nèi)FR和谷氨酸雙標(biāo)神經(jīng)元的數(shù)目明顯少于生理鹽水對(duì)照組和未處理對(duì)照組，而兩組對(duì)照之間無(wú)明顯差異，說(shuō)明小腦間位核DON注射

8、減少了小腦間位核—下丘腦外側(cè)區(qū)的谷氨酸能神經(jīng)投射。
　　 4．雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射DON(50mM)后第3天，下丘腦內(nèi)谷氨酸含量顯著低于生理鹽水對(duì)照組和未處理對(duì)照組，而兩組對(duì)照之間無(wú)顯著性差異。雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射低劑量DON(5mM)后，下丘腦內(nèi)谷氨酸含量沒有明顯改變。此結(jié)果進(jìn)一步證明雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射DON（50mM）減少了小腦—下丘腦的谷氨酸能神經(jīng)投射。
　　 5．在小腦間位核—下丘腦谷氨酸能神經(jīng)投射減少的同時(shí)，

9、即在雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射DON(50mM)后的第3天，動(dòng)物外周血中淋巴細(xì)胞的百分比、淋巴結(jié)T細(xì)胞對(duì)Con A的增殖能力和血清中抗綿羊紅細(xì)胞的IgM抗體水平均顯著降低，而兩組對(duì)照（生理鹽水對(duì)照和未處理對(duì)照）之間無(wú)顯著性差異。然而，低劑量的DON（5mM）注射沒有明顯改變上述免疫功能。說(shuō)明減少小腦間位核—下丘腦的谷氨酸能神經(jīng)投射可導(dǎo)致免疫功能減弱。
　　 6．在小腦皮質(zhì)內(nèi)注射DON（50mM），沒有改變下丘腦內(nèi)谷氨酸的含量也不影響外

10、周血中淋巴細(xì)胞百分比、淋巴結(jié)T細(xì)胞對(duì)ConA的增殖能力和血清中抗綿羊紅細(xì)胞的IgM抗體水平。這一陰性結(jié)果進(jìn)一步證明上述免疫功能的變化確實(shí)由小腦間位核—下丘腦的谷氨酸能神經(jīng)投射所介導(dǎo)。
　　 結(jié)論：
　　 1．小腦間位核至下丘腦外側(cè)區(qū)存在直接的谷氨酸能神經(jīng)投射。
　　 2．小腦間位核內(nèi)注射DON減弱了間位核至下丘腦的谷氨酸能神經(jīng)投射。
　　 3．減弱小腦間位核—下丘腦的谷氨酸能神經(jīng)投射導(dǎo)致免疫功能的抑制，提

11、示小腦的免疫調(diào)節(jié)信息由小腦間位核—下丘腦的谷氨酸能神經(jīng)投射所傳遞。
　　 第二部分小腦間位核GABA能神經(jīng)投射調(diào)節(jié)免疫功能的途徑
　　 目的：
　　 我們?cè)诒疚牡牡谝徊糠盅芯恐幸颜f(shuō)明小腦間位核—下丘腦的谷氨酸能神經(jīng)投射可調(diào)節(jié)免疫功能。在這部分工作中，我們探討小腦間位核的另一傳出途徑——GABA能神經(jīng)投射對(duì)免疫功能的影響，以更深層次地理解和解釋小腦間位核調(diào)節(jié)免疫功能的作用途徑。
　　 方法：
　　

12、1．在一側(cè)下丘腦外側(cè)區(qū)微量注射逆行神經(jīng)束路追蹤劑FR，觀察小腦間位核內(nèi)FR逆行標(biāo)記的神經(jīng)元，同時(shí)，結(jié)合GABA熒光免疫組織化學(xué)法探討小腦間位核投射至下丘腦的神經(jīng)元中是否存在GABA能神經(jīng)元。
　　 2．雙側(cè)小腦間位核內(nèi)分別微量注射GABA合成酶抑制劑3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid,3-MP）、GABA轉(zhuǎn)氨酶抑制劑氨己烯酸(vigabatrin，VGB)以分別減弱或增強(qiáng)間位核的GABA能神經(jīng)投射，并

13、以雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射等量生理鹽水及未經(jīng)任何處理的動(dòng)物作為對(duì)照。同時(shí)，腹腔注射小牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)免疫大鼠。術(shù)后第3天，流式細(xì)胞儀檢測(cè)動(dòng)物外周血單個(gè)核細(xì)胞中T和B淋巴細(xì)胞百分比的變化；用CFSE和結(jié)合PE的抗大鼠CD3抗體雙標(biāo)腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞對(duì)ConA刺激的增殖能力的變化；ELISA檢測(cè)血清中抗BSAIgM抗體水平的變化。
　　 3．雙側(cè)小腦間位核注射3-M

14、P或VGB后第3天，HPLC測(cè)定下丘腦內(nèi)GABA、淋巴結(jié)和脾臟中去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）含量的變化。
　　 4．雙側(cè)小腦間位核注射3-MP或VGB后第3天，ELISA試劑盒檢測(cè)血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、皮質(zhì)醇(cortisol)、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、三碘甲狀腺原氨酸(3,5,3’

15、-triiodothyronine，T3)、四碘甲狀腺原氨酸（3,5,3’,5’-tetraiodothyronine，T4）水平的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1．下丘腦外側(cè)區(qū)微量注射FR后逆行追蹤至對(duì)側(cè)小腦間位核，可見到FR標(biāo)記的神經(jīng)元；利用GABA熒光免疫組織化學(xué)法染色小腦間位核，發(fā)現(xiàn)這些FR標(biāo)記的神經(jīng)元中存在GABA陽(yáng)性神經(jīng)元，此結(jié)果證明小腦間位核與下丘腦外側(cè)區(qū)之間存在直接的GABA能神經(jīng)投射。
　　 2．

16、雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射3-MP后第3天，外周血單個(gè)核細(xì)胞中的T和B淋巴細(xì)胞百分比、淋巴結(jié)T細(xì)胞對(duì)Con A的增殖能力、血清中抗BSA的IgM抗體水平均較兩組對(duì)照顯著升高；而雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射VGB后第3天，外周血單個(gè)核細(xì)胞中的T和B淋巴細(xì)胞百分比、淋巴結(jié)T細(xì)胞對(duì)Con A的增殖能力、血清中抗BSA的IgM抗體水平均較兩組對(duì)照顯著降低。在兩組對(duì)照之間，即雙側(cè)間位核內(nèi)注射生理鹽水的對(duì)照組和未作任何處理的對(duì)照組之間，上述免疫指標(biāo)無(wú)顯著性差異。

17、這些結(jié)果表明減弱小腦間位核的GABA能神經(jīng)投射促進(jìn)了T和B細(xì)胞的功能，而增強(qiáng)小腦間位核的GABA能神經(jīng)投射則抑制了T和B細(xì)胞的功能。
　　 3．在免疫功能發(fā)生變化的同時(shí)，即在雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射3-MP后第3天，下丘腦內(nèi)GABA含量明顯降低；而注射VGB后第3天，下丘腦內(nèi)GABA含量顯著升高。在兩組對(duì)照之間，下丘腦內(nèi)的GABA含量無(wú)顯著性差異。這些結(jié)果表明間位核內(nèi)注射3-MP減弱了間位核—下丘腦的GABA能神經(jīng)投射，而間位核內(nèi)注

18、射VGB則增強(qiáng)了間位核—下丘腦的GABA能神經(jīng)投射。因此提示，上述間位核內(nèi)注射3-MP或VGB導(dǎo)致的免疫功能改變可由間位核—下丘腦的GABA能神經(jīng)投射介導(dǎo)。
　　 4．在免疫功能發(fā)生變化的同時(shí)，即在雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射3-MP后的第3天，腸系膜淋巴結(jié)和脾臟中的NE含量降低，而注射VGB后的第3天，腸系膜淋巴結(jié)和脾臟中的NE含量升高，兩對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。這些結(jié)果表明，間位核內(nèi)注射3-MP或VGB導(dǎo)致的免疫功能改變可由交感神經(jīng)

19、這一外周途徑介導(dǎo)。
　　 5．在免疫功能發(fā)生變化的同時(shí)，即在雙側(cè)小腦間位核內(nèi)注射3-MP或VGB后的第3天，血清中的ACTH、皮質(zhì)醇、TSH、T3和T4的水平與兩對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，說(shuō)明腺垂體一腎上腺皮質(zhì)/甲狀腺途徑可能不參與介導(dǎo)小腦間位核GABA能神經(jīng)投射的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)論：
　　 1．小腦間位核至下丘腦外側(cè)區(qū)存在直接的GABA能神經(jīng)投射。
　　 2．小腦間位核的GABA能神經(jīng)投射可調(diào)節(jié)T