近江牡蠣HSP70基因轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控因子DSP1鑒定.pdf

1、70 kDa熱休克蛋白（Heat shock proteins70，HSP70s）是熱休克蛋白超家族中的重要成員，作為分子伴侶，它能夠促進(jìn)新生肽的正確折疊，對變性蛋白質(zhì)恢復(fù)正確折疊或不能復(fù)性蛋白的降解具有重要作用。研究表明基因在正調(diào)控因子作用下首先出現(xiàn)高表達(dá)，后期受負(fù)調(diào)控因子抑制作用恢復(fù)至初始水平。HSP70s基因的表達(dá)模式也是如此，但是其負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子還未知。本研究以近江牡蠣HSP70（Crassostrea hongkongensi

2、s HSP70，ChHSP70）基因的轉(zhuǎn)錄因子為目標(biāo)，通過 DNA親和純化和質(zhì)譜測序篩選出 ChHSP70的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，鑒定出ChHSP70的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一ChDSP1蛋白；通過RACE技術(shù)和三維建模確定ChDSP1的全長cDNA序列以及蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)；采用EMSA，qRT-PCR，體外過表達(dá)以及RNAi等方法鑒定ChDSP1對ChHSP70基因的負(fù)調(diào)控功能。具體研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　　近江牡蠣ChDSP1基因cDNA全

3、長1348 bp，編碼區(qū)609 bp，5’端和3’端非編碼區(qū)長度分別為119 bp和620 bp。三維建模確定ChDSP1蛋白質(zhì)含有兩個HMG結(jié)構(gòu)域和一個酸性尾巴，每個HMG結(jié)構(gòu)域由三個α螺旋形成一個L型結(jié)構(gòu)，位于C端的酸性尾巴由多個連續(xù)的天冬氨酸構(gòu)成。
　　原核表達(dá)并純化獲得ChDSP1蛋白，用FITC熒光標(biāo)記ChHSP70調(diào)控序列核心區(qū)片段（-304到+72，長376 bp），將兩者用于EMSA（Electrophoretic

4、 Mobility Shift Assay）研究，結(jié)果表明 ChDSP1與 ChHSP70的啟動子區(qū)片段可以結(jié)合，經(jīng)過熱競爭和冷競爭實驗進(jìn)一步肯定兩者結(jié)合具有特異性。
　　通過細(xì)胞體外過表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后無ChDSP1蛋白表達(dá)的對照組，其ChHSP70報告基因在0-6 h期間顯著高表達(dá)（p＜0.05），在12 h-72 h出現(xiàn)極顯著高表達(dá)（p＜0.01）；而實驗組在ChDSP1蛋白過表達(dá)情況下，ChHSP70報告基因的表達(dá)受抑制

5、。表明在ChDSP1蛋白存在的條件下，ChHSP70的表達(dá)受到明顯抑制。
　　在 mRNA水平用 qRT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn) ChDSP1相對于 ChHSP70的表達(dá)存在滯后性：將近江牡蠣熱休克（37℃）1 h后，在其恢復(fù)過程中，檢測鰓組織中的ChHSP70和ChDSP1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)ChHSP70高表達(dá)峰值出現(xiàn)在6 h左右，而ChDSP1高表達(dá)峰值出現(xiàn)在12 h左右，相對于ChHSP70的表達(dá)，ChDSP1的表達(dá)出現(xiàn)滯后性