可控酶解蠶蛹蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽及其構(gòu)效關(guān)系的研究.pdf

1、高血壓是最常見(jiàn)的心血管疾病之一，它能造成大腦、心血管、腎臟的損害，是導(dǎo)致腦卒中、心力衰竭和冠心病等疾病的重要因素。天然食品中的降血壓功能因子由于無(wú)副作用，已成為非藥物控制高血壓進(jìn)程的理想選擇。利用生物酶水解食物蛋白所生成的肽類能夠表現(xiàn)出不同的生物活性，這些生物活性肽在消化降解和食物加工制作過(guò)程中可從其前體蛋白中釋放出來(lái)。
　　 蠶蛹蛋白是一種高營(yíng)養(yǎng)蛋白，我國(guó)每年的蠶蛹產(chǎn)量非常高，但是至今蠶蛹蛋白的綜合利用途徑還不完善，形成的產(chǎn)品

2、附加值也不高。本研究通過(guò)可控酶解的辦法，對(duì)利用蠶蛹蛋白制備具有降血壓效果的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　 本文首先建立起了一種快速方便檢測(cè)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽活性的RP—HPLC方法，并優(yōu)化了底物HHL與ACE酶作用轉(zhuǎn)化為馬尿酸(HA)的最佳反應(yīng)當(dāng)量，得出了HHL和ACE之間最優(yōu)的定量關(guān)系是：HHL為5mM濃度時(shí)體積為6μL，ACE為0.1U/ml濃度下10μL。通過(guò)對(duì)蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物活性的測(cè)定，證明該方法具有快

3、速、方便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
　　 通過(guò)利用不同蛋白酶對(duì)蠶蛹蛋白進(jìn)行水解，得出酸性蛋白酶(Aspergillus usamii N0．537)水解的產(chǎn)物具有ACE抑制活性高、苦味低、色澤好、溶液穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，確定利用酸性蛋白酶作為水解蠶蛹蛋白的首選酶。通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)、部分因子優(yōu)化和中心點(diǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，得出了酸性蛋白酶水解蠶蛹蛋白的最優(yōu)的水解條件為水解溫度35℃，水解時(shí)間4.92 h，酶比底物(w/w)為1％(相當(dāng)于500U/g底物)

4、，底物濃度(水/蠶蛹蛋白)為14.94(w/v)，pH為2.18，使水解產(chǎn)物的ACE抑制活性IC50從單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果的2.5mg/mL增強(qiáng)到1.38mg/mL。
　　 利用傳統(tǒng)的Osborne蛋白提取方法，根據(jù)每種蛋白組分的溶解特性的區(qū)別，提取到了四種蛋白組分，在蠶蛹蛋白中，蛋白組分的含量特點(diǎn)為清蛋白＞谷蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白。清蛋白組分為蠶蛹粉中的優(yōu)勢(shì)蛋白組分。對(duì)四種蛋白組分的氨基酸組成分析表明，清蛋白的必需氨基酸占總氨基酸的

5、44.58％，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為80.43％，比WHO/FAO提出的必需氨基酸占總氨基酸的40％，和必需氨基酸與非必需氨基酸之比為60％的參考蛋白模式要高。
　　 通過(guò)中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法得出了清蛋白的最佳提取條件為：水/蛋白原料在6.8，提取時(shí)間5h，使清蛋白的純蛋白得率從17.39g/100g蛋白原料上升到26.41g/100g蛋白原料，提高了34％。總蛋白得率達(dá)到61.83％。
　　 了解潛在的具有抗高

6、血壓活性蛋白原料的具體組成成分，以及明確哪種蛋白組分對(duì)ACE抑制活性起主要貢獻(xiàn)作用，對(duì)更好的開(kāi)發(fā)該蛋白原料具有重要意義。通過(guò)對(duì)蠶蛹蛋白組分的分子量分布特點(diǎn)和其水解產(chǎn)物的分子量分布情況與其ACE抑制活性之間的關(guān)系進(jìn)行研究，得出蠶蛹蛋白組分中，清蛋白組分的ACE抑制率最高，水解度也最高，表明清蛋白易于被酸性蛋白酶水解，所得小肽分子生物活性強(qiáng)。
　　 對(duì)清蛋白組分經(jīng)酸性蛋白酶酶解后的產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)超濾、凝膠過(guò)濾、多維液相系統(tǒng)和離子阱質(zhì)譜的

7、逐步分離和檢測(cè)，得出一個(gè)新的ACE抑制肽，其結(jié)構(gòu)為“SEPTVF”，通過(guò)化學(xué)同相合成法合成六肽SEPTVF，檢測(cè)ACE抑制活性，得出此活性肽ACE抑制活性的IC50值為324μM。
　　 以20個(gè)已經(jīng)公布了結(jié)構(gòu)和活性數(shù)據(jù)的ACE抑制肽作為訓(xùn)練集，生成了ACE抑制肽的藥效團(tuán)模型(Hypo1)。將從蠶蛹蛋白中得到的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(set—glu—pro—thr—val—phe)與該選擇的藥效團(tuán)模型Hypo1進(jìn)行疊合比較，識(shí)別

8、其對(duì)ACE抑制活性起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)部分，證明此活性肽的thr—val—phe部分對(duì)其ACE的抑制活性起主要作用。
　　 通過(guò)研究自發(fā)性高血壓大鼠血壓(spontaneously hypertensive rat，SHR)攝入清蛋白酶解產(chǎn)物前后動(dòng)脈收縮壓的變化，得出清蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠具有短期和長(zhǎng)期降低動(dòng)脈收縮壓的效果。
　　 本論文的研究結(jié)果為綜合利用蠶蛹蛋白，利用蠶蛹蛋白制備具有高經(jīng)濟(jì)附加值的降血壓活性肽制