電脈沖導(dǎo)入干擾素基因在活體內(nèi)的低損傷、長(zhǎng)效表達(dá)的研究.pdf

1、干擾素是最早以基因工程技術(shù)制成藥物并應(yīng)用于臨床治療的細(xì)胞因子類蛋白質(zhì)，該家族是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)抵抗異源物入侵、啟動(dòng)早期的免疫反應(yīng)以及調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)免疫過(guò)程的重要成員。它是目前用于疾病治療，尤其是病毒引起的疾病中最常用的細(xì)胞因子類藥物，其在免疫治療應(yīng)用中的潛力巨大。但是，目前市場(chǎng)上應(yīng)用的干擾素重組蛋白在體內(nèi)的代謝半周期短，為維持藥效所需，需采取多次重復(fù)注入高劑量的干擾素蛋白制劑的用藥方案，此給藥方式常伴隨著很多嚴(yán)峻的副作用產(chǎn)生。為此，我們進(jìn)行了干擾

2、素基因治療的可行性研究，利用電脈沖介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，試圖找出能使干擾素基因在肌肉中達(dá)到高轉(zhuǎn)染、長(zhǎng)表達(dá)以及低肌肉損傷的效果的條件。 我們首先以可定量的熒火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)分析電擊參數(shù)與基因轉(zhuǎn)染效率以及肌纖維損傷的影響。權(quán)衡兩效應(yīng)與最終轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的關(guān)系，我們認(rèn)為相對(duì)于高電壓條件（200V/cm），100V/cm的低電壓更符合高轉(zhuǎn)染效率、低組織損傷的設(shè)想。故此，我們以100V/cm的電壓條件為基準(zhǔn)，在小鼠體內(nèi)展開(kāi)一系列

3、的電擊參數(shù)(包括電脈沖時(shí)間、電脈沖次數(shù)、電擊電場(chǎng)作用范圍、注射質(zhì)粒在肌組織的分布面積、電擊電場(chǎng)與肌纖維取向間夾角等) 實(shí)驗(yàn)研究，得出在100V/cm條件下，單個(gè)短電脈沖時(shí)間（10ms/pulse）比長(zhǎng)脈沖(50ms/pulse)更能保持在高轉(zhuǎn)染效率下的低損傷水平，而電脈沖個(gè)數(shù)對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率的影響則不顯著；相反，通過(guò)增加電極個(gè)數(shù)（從雙電極變?yōu)槿姌O的電擊方式）以增加電擊電場(chǎng)作用范圍以及保持電擊電場(chǎng)方向與肌纖維取向垂直的操作，則可在電脈沖條

4、件不變的情況下，獲得基因轉(zhuǎn)染效率的提高。 我們還就干擾素具有胞外分泌、在異物種間具有高免疫原性等特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了在真核生物活體內(nèi)的高表達(dá)質(zhì)粒載體系統(tǒng)，以了解這些特質(zhì)在干擾素肌肉內(nèi)轉(zhuǎn)基因治療效果的影響。為此我們同時(shí)構(gòu)建了人源干擾素高效表達(dá)質(zhì)粒(hIFN-α2-gWiz)以及在小鼠中為內(nèi)源性低免疫原的鼠源干擾素高效表達(dá)質(zhì)粒(mIFN-α4-gWiz)，并以熒火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)中所得的電擊參數(shù)為基礎(chǔ)，以雌性BALb/c小鼠為活體

5、模型，以進(jìn)一步研究電擊介導(dǎo)的干擾素肌肉內(nèi)基因治療的預(yù)備方案以及找出最終能對(duì)其在血液內(nèi)的表達(dá)水平構(gòu)成影響的關(guān)鍵因素。在血液水平，干擾素的分泌特性的影響顯著，人源干擾素蛋白在血液中的表達(dá)曲線較報(bào)告基因在肌肉中的表達(dá)趨勢(shì)有所不同，但電擊對(duì)基因轉(zhuǎn)染的提高的作用依然突出，其中尤以首7天最為明顯，其分泌到血液中的蛋白水平在第一天已有顯著的提高，并迅速達(dá)到峰值，最終緩慢減至穩(wěn)定水平。而干擾素具有的在異物種間的高免疫原性則體現(xiàn)在重復(fù)電擊注射實(shí)驗(yàn)上，人源

6、干擾素的再次電擊注射的效益低，血液中分泌蛋白的水平未見(jiàn)提升，在檢測(cè)的14日間始終維持在低分泌水平。為此，必須進(jìn)一步研究電擊介導(dǎo)的鼠源干擾素表達(dá)載體系統(tǒng)在小鼠肌肉、血液中的表達(dá)水平與變化情況，以確定最終在大型動(dòng)物中應(yīng)用內(nèi)源性干擾素基因治療技術(shù)的可行性以及最優(yōu)化的參數(shù)選項(xiàng)。 綜合干擾素肌肉內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平以及其分泌蛋白在血液中的代謝動(dòng)力學(xué)曲線，我們相信，進(jìn)一步優(yōu)化電導(dǎo)脈沖中各參數(shù)的條件，將可使肌肉中電擊介導(dǎo)的裸基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在以細(xì)胞