腎康注射液及藥效物質(zhì)對慢性腎臟疾病的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、慢性腎臟疾?。–hronic kidney disease，CKD）具有很高的發(fā)病率，目前全世界的患病率已達(dá)8–16％，嚴(yán)重危害病人健康、加重家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。臨床上治療此種疾病的藥物有：利尿藥、糖皮質(zhì)激素藥、抗高血壓藥和免疫抑制藥，但這些藥物存在副作用大，不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)。中藥治療CKD具有悠久的歷史，目前臨床上使用較多的中藥有腎康注射液（Shenkang injection，SKI）、腎康丸和黃芪當(dāng)歸合劑。但因?yàn)檫@些中藥復(fù)方制劑

2、藥效物質(zhì)不清，作用機(jī)制不明，很難得到大眾的認(rèn)可。本研究中，我們選用SKI為研究對象，首先采用大鼠和細(xì)胞模型確定SKI的藥效和機(jī)制，然后根據(jù)已檢測出的 SKI的所有活性成分，運(yùn)用體內(nèi)和體外模型篩選其活性成分中抗氧化和抗纖維化最有效的成分，從而揭示其藥效物質(zhì)，并探索藥效物質(zhì)治療慢性腎臟疾病的分子機(jī)制。
　　【目的】
　　1.確定SKI的藥效，同時探討其抗纖維化和抗氧化應(yīng)激的機(jī)制。
　　2.運(yùn)用大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化物模型和

3、HK-2細(xì)胞模型，探討SKI中10個中藥單體：大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、沒食子酸、原兒茶醛、丹參素以及毛蕊異黃酮抗氧化和抗纖維化的效果，篩選治療CKD潛在的藥物。
　　3.應(yīng)用5/6Nx大鼠模型和HK-2細(xì)胞考察大黃酸治療CKD的藥效和作用機(jī)制。
　　【方法】
　　1.通過5/6腎切除（5/6Nx）建立大鼠慢性腎損傷模型。檢測血中肌酐和尿素氮，觀察組織形態(tài)學(xué)的變化。檢測腎組織中腎纖維化相關(guān)指標(biāo)纖連

4、蛋白（FN）、膠原Ι、α-肌動蛋白（α-SMA）、轉(zhuǎn)錄生長因子-β（TGF-β）和p-Smad3的表達(dá)。同時考察腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）中TGF-β/Smad3通路對腎纖維化和氧化應(yīng)激的影響。
　　2.通過檢測SKI中這10種中藥單體抑制大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化物、清除自由基的能力，以及對HK-2細(xì)胞中氧化損傷指標(biāo)：活性氧(ROS)、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和氧化性谷胱甘肽（GSSG）的影響，

5、考察其抗氧化的能力。通過檢測HK-2細(xì)胞中TGF-β和結(jié)締組織生長因子（CTGF）蛋白的表達(dá)考察其抗纖維化的能力。
　　3.采用HE、MASSON、TUNEL染色和電鏡觀察5/6Nx腎組織病理結(jié)構(gòu)、間質(zhì)纖維化、細(xì)胞凋亡和超微結(jié)構(gòu)的變化，同時用免疫印跡法測量大鼠腎組織纖維化和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化。建立 SIRT3基因沉默的 HK-2細(xì)胞模型，檢測 FOXO3α蛋白；氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)：ROS、8-羥化脫氧鳥苷（8-OHdG）、p47

6、phox和gp91phox；纖維化相關(guān)指標(biāo)：α-SMA、鈣粘蛋白（E-cadherin）和TGF-β；以及凋亡相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1.5/6Nx大鼠經(jīng)SKI和依那普利處理后可以降低血中肌酐和尿素氮，改善腎組織形態(tài)學(xué)的變化，降低TGF-β/Smad3信號通路和腎組織纖維化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，如FN、collageΙ和α-SMA。在HK-2細(xì)胞中，經(jīng)TGF-β和H2O2刺激后，纖維化和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)增加，SKI處理

7、后，能夠通過抑制TGF-β和p-Smad3的表達(dá)減輕細(xì)胞的纖維化和氧化損傷。
　　2.大黃酸、大黃素、沒食子酸、迷迭香酸、原兒茶醛和丹參素這幾種單體具有抑制脂質(zhì)過氧化物和清除自由基的能力，其中大黃酸、大黃素和迷迭香酸減輕HK-2細(xì)胞氧化損傷和纖維化的能力比其它7種成分強(qiáng)，同時還能增加HK-2細(xì)胞的存活力，降低乳酸脫氫酶（LDH）的釋放。
　　3.大黃酸可以改善腎組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的變化，減少腎細(xì)胞凋亡，減輕腎間質(zhì)纖維化和氧化

8、損傷。通過激活 SIRT3/FOXO3α信號通路，大黃酸可以改善細(xì)胞氧化應(yīng)激和纖維化，但不能減少細(xì)胞凋亡。
　　【結(jié)論】
　　1. SKI通過下調(diào)TGF-β/Smad3信號通路抑制腎的纖維化和氧化損傷。
　　2.大黃酸、大黃素和迷迭香酸具有很強(qiáng)的抗氧化和抗纖維化的作用，能夠成為治療CKD重要的候選藥物。
　　3.大黃酸通過抗氧化、抗纖維化和抗凋亡保護(hù)5/6Nx大鼠的腎損傷，其抗氧化和抗纖維化的作用與激活SIRT3