重組人IL-31的原核表達(dá)、純化及其皮膚炎癥相關(guān)性研究.pdf

1、目的:探索人IL-31在原核細(xì)胞中的表達(dá)、純化和復(fù)性的方法，研究人IL-31與皮膚炎癥的相關(guān)性。 方法:(1)將含有表達(dá)質(zhì)粒pET-32a/rhlL-31和pET-28a/rhlL-31的重組菌Ecli.BL21(DE3)分別37℃培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE初步觀察重組蛋白rhlL-31的表達(dá)量并對(duì)其進(jìn)行初步分析。對(duì)兩種表達(dá)菌株分別進(jìn)行連續(xù)傳代，比較其穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)效率，選擇較穩(wěn)定、表達(dá)效率較高的菌株作為后續(xù)

2、研究的工程菌。(2)將目的蛋白條帶送檢進(jìn)行氨基酸序列分析。(3)破碎菌體，洗去雜蛋白，溶解包涵體，過(guò)Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF柱純化。(4)對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行透析復(fù)性。(5)Brad-Ford法測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE和薄層掃描分析純化產(chǎn)物中目的蛋白的純度和含量。(6)用獲得的復(fù)性后rhIL-31蛋白以不同的劑量對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行分組皮內(nèi)注射，觀察其皮膚和行為變化，7天后取注射部位皮膚作石蠟切片并進(jìn)行HE染色，觀察皮膚組織的炎性細(xì)胞

3、浸潤(rùn)情況；同時(shí)作小鼠外周血常規(guī)檢測(cè)，觀察其外周血的細(xì)胞學(xué)變化；眼球采血收集血清，檢測(cè)IL-4，IL-10，IFN-γ水平，分析其外周血Th1/Th2細(xì)胞的平衡變化。(7)無(wú)菌分離人外周血淋巴細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)不同濃度rhIL-31對(duì)人淋巴細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果:(1)pET-32aJrhIL-31和pET-28a/rhIL-31在E.coli.BL21(DE3)中均獲得表達(dá)，反復(fù)多次試驗(yàn)證實(shí)，前者能較穩(wěn)定而高效地表達(dá)rhIL

4、.31。(2)氨基酸序列分析證實(shí)，我們獲得的重組蛋白與人IL-31氨基酸序列一致。(3)pET-32a/rhIL-31在E.coli.BL21(DE3)中37℃誘導(dǎo)過(guò)夜時(shí)表達(dá)效率達(dá)到最高，為29％，可溶性包涵體中rhlL-31的純度為34％，含量占rhIL-31總量的19.9％，經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF柱純化，獲得純度為83％的目的蛋白產(chǎn)物，rhIL-31含量占rhIL-31總量的16.5％，過(guò)柱后蛋白平均得率為32.4％。(4)復(fù)

5、性后重組蛋白有生物學(xué)活性，能夠刺激BALB/C小鼠皮膚炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)撓抓、脫毛、躁狂等現(xiàn)象，皮膚病理切片顯示處理組注射部位表皮增厚，角質(zhì)層肥厚，真皮及皮下均有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，并在一定范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。(5)小鼠外周血常規(guī)顯示，受試各組外周血中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞比例均較對(duì)照組高，并在一定范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。(6)小鼠血清學(xué)檢測(cè)提示，進(jìn)行皮內(nèi)rhIL-31注射的組別，其IL-4、IL-1

6、0、OL-4/IFN-γ)平均水平均較正常對(duì)照組有所升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(7)MTT實(shí)驗(yàn)提示，rhIL-31對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞增殖情況有一定的抑制作用。 結(jié)論:(1)Ecoli.BL21(DE3)中pET-32a/rhIL-31的表達(dá)效率較pET-28a/rhIL-31高且穩(wěn)定，表達(dá)效率在37℃過(guò)夜時(shí)最高，占菌體蛋白總量的29％，可溶性包涵體中rhIL-31的純度為34％，含量占rhIL-31總量的19.9％，經(jīng)Ni-NTA瓊

7、脂糖凝膠FF柱純化，獲得純度為83％的目的蛋白產(chǎn)物，rhIL-31含量占rhIL-31總量的16.5％，過(guò)柱后蛋白得率平均為32.4％。(2)rhIL-31可刺激BALB/C小鼠出現(xiàn)脫毛和皮膚炎癥，能導(dǎo)致小鼠Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平的改變，使其向Th2型細(xì)胞應(yīng)答偏移，這與人類(lèi)特應(yīng)性皮炎的病理以及血清學(xué)改變相似，暗示IL-31可能與特應(yīng)性皮炎等皮膚炎癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，在Th1、Th2細(xì)胞應(yīng)答的平衡中發(fā)揮一定作用。(3)本研究為rhI