重組人IL-31抗體制備及其拮抗皮膚炎癥的研究.pdf

1、目的：高效表達(dá)重組人IL-31，從而制備IL-31抗體（多克隆抗體/單克隆抗體），探討IL-31抗體拮抗皮膚炎癥的作用，為研發(fā)IL-31抗體治療性新藥打下基礎(chǔ)。 方法：（1）培養(yǎng)工程菌株E.coli BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體并超聲破碎，用鎳NTA瓊脂糖凝膠柱純化重組蛋白，定量后分裝備用。（2）重組人IL-31蛋白溶液加等體積的佐劑完全乳化后免疫家兔，制備兔抗人IL-31多克隆抗體。并且經(jīng)ELISA和We

2、stern Blot進(jìn)行鑒定。（3）將IL-31多克隆抗體分為三個劑量10μg、20μg、40μg經(jīng)皮下注射和受損皮膚直接涂抹的途徑，對已經(jīng)致皮膚炎癥的Balb/c小鼠治療7天，同時設(shè)置陰性對照組（未治療組）和空白對照組，治療后3天取治療部位皮膚作石蠟切片進(jìn)行HE染色觀察組織學(xué)變化，同時定量檢測小鼠血清中IL-6，IL-8，L選擇素和MIP-3β等炎性細(xì)胞因子的變化。（4）分析并合成IL-31的優(yōu)勢抗原表位，合成多肽后與牛血清蛋白交聯(lián)，

3、免疫小鼠以制備單克隆抗體。采用Protein A親和層析法純化抗體，并且經(jīng)ELISA和Western Blot進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：（1）SDS-PAGE電泳證實獲得了高純度的純化人IL-31蛋白。（2）用重組人IL-31蛋白疫苗免疫健康家兔，誘導(dǎo)出高滴度的特異性抗體，在免疫后4周達(dá)到高峰，5～6周穩(wěn)定在高水平。采用鹽析法初步純化抗體，并且經(jīng)間接ELISA法檢測后的兔血清抗體效價為1：15000～1：20000，雙向瓊脂擴(kuò)散效價為1

4、：16。通過Western blot結(jié)果證明重組人IL-31蛋白能與抗IL-31多克隆抗體特異性結(jié)合。（3）小鼠皮膚組織切片HE染色顯示，治療組皮下和皮內(nèi)均有炎癥細(xì)胞浸潤，并且呈現(xiàn)一定程度的劑量依賴性趨勢，與陰性對照組比較，炎癥細(xì)胞的浸潤明顯減少。（4）小鼠血清中炎性因子ELISA檢測顯示，涂抹組和注射組小鼠血清中IL-6、IL-8均明顯低于陰性對照組（p<0.05）。同一劑量進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)兩種用藥途徑之間沒有顯著差異。涂抹組和注射

5、組小鼠血清中L選擇素均明顯低于陰性對照組，高于空白對照組。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，注射組與陰性對照組無顯著性差異（p>0.05）。涂抹組和注射組小鼠血清中MIP-3β平均值明顯低于陰性對照組（p<0.05）。治療組同一劑量進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)兩種用藥途徑之間沒有顯著差異。（5）通過間接ELISA法檢測兩株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水抗體效價分別為1：10000（8A1株）和1：20000（8C3株）。通過Western Blot檢測兔血清抗體和兩株雜交瘤細(xì)

6、胞分泌的抗體均與重組人IL-31蛋白特異性結(jié)合。通過間接ELISA法檢測抗體亞型為IgG3。 結(jié)論：（1）獲得高效穩(wěn)定表達(dá)的重組人IL-31蛋白，以此作為免疫原免疫家兔，獲得到了效價較高的兔抗人IL-31多克隆抗體。（2）兔抗人IL-31多克隆抗體，使皮膚致炎的炎性細(xì)胞減少，使小鼠血清中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子明顯降低，提示IL-31與特應(yīng)性皮炎等皮膚炎癥的發(fā)病機制有關(guān)，人IL-31多克隆抗體具有拮抗作用，本研究為IL-31多克隆抗體治