AnnexinA2抗體制備及其應(yīng)用的實驗研究.pdf

1、　　目的：為了研究人源膜聯(lián)蛋白 A2(AnnexinA2)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,探討annexinA2作為腫瘤分子靶點在腫瘤診斷及治療中的應(yīng)用,我們制備了其多克隆及單克隆抗體并進(jìn)行了相關(guān)研究。
　　方法：(1)用PCR克隆人的AnnexinA2的基因編碼區(qū),將其克隆入原核表達(dá)載體pET28a(+),構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)/AnnexinA2.(2)將構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.co li BL21(DE3)

2、中,用IPTG誘導(dǎo)目的基因的表達(dá),通過超聲裂解和SDS-PAGE 檢測重組蛋白的表達(dá)。表達(dá)的蛋白產(chǎn)物利用切膠回收的方法純化, SDS-PAGE檢測純化情況,Western Blot鑒定重組蛋白。(3) 將純化并透析、濃縮的重組蛋白免疫兔子,耳緣靜脈取血測定兔血清的效價,效價達(dá)到300000以上,動脈插管取血,收獲的兔血清既為多克隆抗體。用間接 ELISA 方法測定抗體的效價,用Western blot檢測抗體的特異性,用細(xì)胞免疫熒光及F

3、CM法檢測細(xì)胞的定位。(4)將純化并透析、濃縮的重組蛋白免疫 Balb/C 小鼠,取效價最高的小鼠作為待融合小鼠；分離該小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,通過HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng),間接 ELISA 法篩選,用有限稀釋法單克隆化,獲得穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將陽性單克隆細(xì)胞腹腔注射至小鼠腹腔,收獲腹水離心后的腹水上清作為單克隆抗體。用間接ELISA檢測抗體的效價,Western Blot和免疫共沉淀檢測抗體的特異性。(

4、5)將制備的抗體應(yīng)用于Western Blot、細(xì)胞免疫熒光(CIF)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM),檢測真核細(xì)胞中目的蛋白的本底表達(dá)情況。(6)用外源的annexinA2單克隆抗體處理HepG2細(xì)胞,用MTT法檢測外源性抗體對細(xì)胞生長增值的影響；FCM檢測細(xì)胞周期；RT-PCR和real-PCR檢測細(xì)胞周期的相關(guān)基因；western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因中CDK6的表達(dá)情況；用劃線法及transwell檢測外源抗體對HepG2細(xì)胞的侵

5、襲及遷移的影響
　　結(jié)果：(1)經(jīng)酶切和DNA測序鑒定,pET28a(+)/AnnexinA2原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建是正確的。(2)原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 E.coli BL21 (DE3),1.0mM IPTG 可誘導(dǎo)AnnexinA2重組蛋白的表達(dá),表達(dá)的重組蛋白以包涵體的形式存在。運用切膠回收的方法純化重組蛋白,SDS-PAGE分析其純度均在80%以上,Western Blot(WB)鑒定顯示重組蛋白各自兼有6×His的標(biāo)簽

6、。(3)將純化的蛋白免疫日本大耳白兔后,制備了特異的高滴度的多克隆抗體( ELISA 滴度達(dá) 1：640000)。Western blot(WB)檢測抗體的具有較好的特異性。CIF 和 FCM 結(jié)果顯示抗血清與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的annexinA2有高度特異的結(jié)合活性。(4) 將純化的重組蛋白作為抗原免疫Balb/C小鼠后,經(jīng)融合、篩選和克隆化,獲得了四株陽性單克隆細(xì)胞株,并制備了腹水上清形式的單克隆抗體。ELISA檢測四株單克隆抗體的效價均

7、在1280000以上。就其中的一株單抗經(jīng)western blot鑒定,制備的單抗不是6×His標(biāo)簽抗體。經(jīng)western blot鑒定單克隆抗體能特異性識別PC3(前列腺癌細(xì)胞)、ECV(人血管內(nèi)皮細(xì)胞)、T24(膀胱癌細(xì)胞)、HepG2(肝癌細(xì)胞)、PANC1(胰腺癌細(xì)胞)及癌組織表達(dá)的annexinA2蛋白,而在癌旁組織中僅僅檢測到很少量的本底表達(dá)的annexinA2蛋白；免疫共沉淀進(jìn)一度證實了單克隆抗體能特異性識別肝癌細(xì)胞內(nèi)本底表

8、達(dá)的annexinA2蛋白。CIF和 FCM結(jié)果顯示腹水形式的單克隆抗體與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的 annexinA2 有高度特異的結(jié)合活性。(5)MTT結(jié)果表明,與對照細(xì)胞相比較,外源的annexinA2單克隆抗體能夠抑制HepG2細(xì)胞的生長,并且隨著抗體處理濃度的降低,抑制HepG2細(xì)胞生長的能力減弱；FCM結(jié)果顯示,外源的單克隆抗體促使G1期延長,G2+M期的時間縮短,促使HepG2細(xì)胞的生長周期阻滯在G0+G1期；RT-PCR和real-

9、PCR結(jié)果顯示,與對照細(xì)胞相比較,外源的單克隆抗體對HepG2細(xì)胞周期的相關(guān)基因的表達(dá)有一定的影響,抑制了細(xì)胞周期相關(guān)基因hCCD1,hE2F1,CDK6的表達(dá),并且隨著抗體處理濃度的降低,抑制hCCD1,hE2F1,CDK6的表達(dá)能力減弱；western blot結(jié)果顯示,外源抗體的處理促使HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白CDK6的表達(dá)降低,并且隨著抗體濃度的增大,抑制CDK6蛋白表達(dá)的能力增強：劃線法及transwell結(jié)果顯示,與對照