C反應(yīng)蛋白介導(dǎo)大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及分子生物變化參與阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、目的:為探討CRP對學(xué)習(xí)記憶及AD發(fā)病機(jī)制相關(guān)分子的影響,通過研究大鼠認(rèn)知行為的影響及海馬和皮層中Aβ產(chǎn)生增多相關(guān)的分子(APP、PS-1、PS-2及BACE)和炎癥因子(CRP、IL-1β、IL-6及TNF-α)蛋白水平和基因水平的變化,以明確CRP能否介導(dǎo)大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及其可能機(jī)制。繼而從細(xì)胞水平進(jìn)一步探索其可能的作用機(jī)制。采用PC12細(xì)胞為研究對象,系統(tǒng)地研究CRP對PC12細(xì)胞毒性作用及可能機(jī)制,為CRP成為治療AD的新靶點提

2、供理論依據(jù)。
　　 方法:(1)40只雄性Sprague-Dawley大鼠(220 g～250 g)隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、CRP組和Aβ25-35組。采用雙側(cè)腦室立體定位(i.c.v.)注射給藥,CRP組和Aβ25-35組分別相應(yīng)給予CRP(25.6μg)和Aβ25-35(10 μg/只),假手術(shù)組給予等體積空白溶劑；手術(shù)14天后,采用Morris水迷宮進(jìn)行定向航行實驗及空間探索實驗檢測其參照和空間學(xué)習(xí)記憶能力；在術(shù)后第

3、20天采用避暗法檢測其長期記憶能力；行為學(xué)檢測后,采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR)和免疫印跡(Western blotting)方法檢測海馬和皮層組織中與“Aβ假說”分子機(jī)制相關(guān)分子(APP、PS-1、PS-2及BACE)及“神經(jīng)炎癥假說”分子機(jī)制相關(guān)炎癥因子(CRP、IL-1β、IL-6及TNF-α)的基因和蛋白表達(dá)水平變化。(2)CRP的細(xì)胞毒性實驗:體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞,應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)法(me

4、thyl thiazolyl tetrazolium,MTT)觀察不同濃度CRP對細(xì)胞活力的影響,并測定細(xì)胞外液乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)活力。(3)采用Real-time PCR和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)研究在亞毒性濃度下作用48小時,CRP濃度作用(1.25 mg/L、2.5 mg/L和5 mg/L)對Aβ生成增加相關(guān)基因(PS-1,PS-2,BACE-1和APP)mRNA表達(dá)和Aβ1-42

5、表達(dá)的影響。(4)采用Real-time PCR和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)研究在亞毒性濃度下(5mg/L),CRP刺激后不同時間(12小時、24小時和48小時),PC12對AB生成增加相關(guān)基因(PS-1,PS-2,BACE-1和APP)mRNA表達(dá)和Aβ1-42表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:(1)在Morris水迷宮定向航行實驗中,游泳軌跡結(jié)果表明盡管在訓(xùn)練初期大多數(shù)動物都是沿邊搜索方式,但正常組和假手術(shù)組比CRP組和gβ組更快

6、地學(xué)會直線搜索方式,導(dǎo)致顯著縮短潛伏期和游泳路程。實驗結(jié)果表明,在Day 1各組動物尋找平臺的潛伏期和所需游泳路程無顯著性差異(F=1.062,P=0.379和F=0.426,P=0.736)；其余四天各組動物尋找平臺的潛伏期有顯著性差異(分別為F=11.257,P=0.000；F=3.749,P=0.021；F=5.569,P=0.003和F=6.359,P=0.002),尋找平臺的所需游泳路程有顯著性差異(分別為F=7.658,P=

7、0.001；F=5.925,P=0.002；F=5.421,P=0.004和F=5.780,P=0.003)。CRP組大鼠與假手術(shù)組大鼠比較,在Day2、Day4和Day5尋找平臺的潛伏期有顯著性延長(分別為P=0.001；P=0.020和P=0.006),在Day2、Day 3、Day4和Day 5尋找平臺的所需游泳路程有顯著性延長(分別為P=0.001；P=0.039；P=0.027和P=0.035)；Aβ25-35組大鼠與假手術(shù)組

8、大鼠比較,在Day 2、Day3、Day 4和Day 5尋找平臺的潛伏期有顯著性延長(分別為P=0.000；P=0.034:P=0.01 l和P=0.006),在Day 2、Day 3、Day 4和Day 5尋找平臺的所需游泳路程有顯著性延長(分別為P=0.001:P=0.002:P=0.011和P=0.026):但正常組與假手術(shù)組相比無顯著性差異?？臻g探索實驗中,各組大鼠90秒內(nèi)游泳的總路程無顯著性差異(F=0.157.P=0.925

9、),但各組大鼠90秒內(nèi)停留在原平臺所在象限(即目的象限)的探索時間和探索路程有顯著性差異(F=5.405,P=0.004；F=3.221,P=0.036)。與假手術(shù)組相比,CRP組和Aβ組大鼠90秒內(nèi)停留在目的象限的探索時間明顯縮短(分別為P=0.048和P=0.019):與假手術(shù)組相比,CRP組和Aβ25-35組大鼠90秒內(nèi)在目的象限探索路程明顯縮短(分別為P=0.044和P=0.032):但正常組與假手術(shù)組相比均無顯著性差異。提示C

10、RP組和Aβ25-35組大鼠的空間記憶能力損傷。在被動避暗實驗的適應(yīng)訓(xùn)練中,各組大鼠進(jìn)入暗室的潛伏期無顯著性差異(F=0.115,P=0.951),表明各組大鼠間喜暗及鉆洞的習(xí)性無顯著性差異。在測試實驗中,各組大鼠進(jìn)入暗室的潛伏期均有顯著性差異(F=6.870,P=0.001)。與假手術(shù)組相比,CRP組和Aβ25-35組大鼠均進(jìn)入暗室的潛伏期明顯縮短(分別為P=0.002和P=0.025)；但正常組與假手術(shù)組相比均無顯著性差異。表明CR

11、P組和Aβ25-35組大鼠的長期記憶受損。大鼠雙側(cè)i.c.v.注射后第22天,Real-time PCR結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,CRP組能顯著提高在皮層組織中APP(P=0.031),IL-1β(P=0.000),IL-6(P=0.048),TNF-α(P=0.000),PS-1(P=0.035),PS-2(P=0.025)和內(nèi)源性CRP(P=0.002)mRNA表達(dá)和提高海馬組織中APP(P=0.019),IL-1β(P=0.000

12、),IL-6(P=0.014),TNF-α(P=0.007)和內(nèi)源性CRP(P=0.002)mRNA表達(dá)；Aβ組也能顯著提高在皮層組織中APP(P=0.013),IL-1β(P=0.000),IL-6(P=0.002),TNF-α(P=0.000),PS-1(P=0.033),PS-2(P=0.020)和內(nèi)源性CRP(P=0.000)mRNA表達(dá)和提高海馬組織中APP(P=0.004),IL-1β(P=0.000),IL-6(P=0.0

13、17),TNF-α(P=0.002)和內(nèi)源性CRP(P=0.035)mRNA表達(dá)。但正常組與假手術(shù)組相比均無顯著性差異。Western blotting結(jié)果表明,與假手術(shù)組相比,CRP組能顯著提高在皮層組織中APP(P=0.001),IL-1β(P=0.003)和IL-6(P=0.006)蛋白表達(dá)和提高海馬組織中IL-1β(P=0.000),BACE(P=0.000),TNF-α(P=0.000)和APP(P=0.000)蛋白表達(dá):Aβ

14、組也能顯著提高在皮層組織中APP(P=0.002),IL-1β(P=0.020)和IL-6(P=0.024)蛋白表達(dá)和提高海馬組織中IL-1β(P=0.000),BACE(P=0.000),TNF-α(P=0.000)和APP(P=0.000)蛋白表達(dá)。但正常組與假手術(shù)組相比無顯著性差異。(2)細(xì)胞實驗結(jié)果表明CRP對PC12細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,細(xì)胞存活率下降,LDH外漏增加,并且呈一定的劑量依賴性；當(dāng)CRP濃度在12.5 mg/L、25

15、 mg/L、50 mg/L和100 mg/L作用48d,時后,與正常對照組比較,細(xì)胞存活率顯著下降(分別為P=0.000,P=0.001,P=0.003和P=0.003):細(xì)胞LDH外漏顯著增加(分別為P=0.001,P=0.007,P=0.032和P=0.042)。(3)在亞毒性濃度下,CRP呈劑量依賴性地提高PS-1,PS-2,BACE-1和APP mRNA表達(dá)和Aβ1-42表達(dá)。不同濃度CRP(1.25 mg/L、2.5mg/L和

16、5 mg/L)能提高PC12細(xì)胞對PS-1,PS-2,BACE-1和APP mRNA表達(dá)及顯著提高Aβ1-42表達(dá)(分別為P=0.001,P=0.000和P=0.000),且呈一定的劑量依賴性；當(dāng)CRP的濃度為5 mg/L時,PC12細(xì)胞對PS-1,PS-2,BACE-1和APP mRNA表達(dá)顯著上升(分別為P=0.000,P=0.000,P=0.000和P=0.000)。(4)CRP呈時間依賴性地提高PS-1,PS-2,BACE-1和

17、APP mRNA表達(dá)和Aβ1-42表達(dá)。在亞毒性濃度(5 mg/L)下,CRP刺激后不同時間(12小時、24小時和48小時),PC12細(xì)胞PS-1,PS-2,BACE-1和APPmRNA表達(dá)升高,并顯著提高Aβ1-42表達(dá)(分別為P=0.026和P=0.001),且呈一定的時間依賴性；當(dāng)5mg/L CRP刺激48小時后,PC12細(xì)胞對PS-1,PS-2,BACE-1和APP mRNA表達(dá)顯著上升(分別為P=0.000,P=0.003,P

18、=0.000和P=0.003),且BACE-1 mRNA表達(dá)在刺激24小時后也顯著上升(P=0.009)。
　　 結(jié)論:i.c.v.注射CRP后能導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙,推測其作用機(jī)制:一方面,可能通過上調(diào)APP,BACE和PS,進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)源性的Aβ大量生成；另一方面,可能通過誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)生,從而導(dǎo)致一系列病理損傷,最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙；CRP對PC12細(xì)胞能產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性作用,且呈濃度依賴性,其作用機(jī)制通過上調(diào)APP,P