咪唑立賓對急性anti-Thy1腎炎大鼠系膜細(xì)胞增殖的抑制作用.pdf

1、背景和目的: 系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積聚是許多類型腎小球疾病的共同特征。繼發(fā)于系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚的腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟病(CKD)進(jìn)展的重要原因。anti-Thyl腎炎模型是模擬人類腎小球疾病建立的以anti-Thyl抗原單克隆抗體誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性系膜增殖性腎小球腎炎動物模型，其病理特征為：系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)積聚。該模型為評估新藥對系膜增殖的影響提供了最佳選擇。研究表明，細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)最終發(fā)

2、生在細(xì)胞周期水平，而細(xì)胞周期又受一系列的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白調(diào)控。咪唑立賓是一種新型免疫抑制劑，可通過抑制IMPDH及GMP合成酶，從而特異地抑制T、B淋巴細(xì)胞的增殖。對于非免疫性異常增殖的系膜細(xì)胞是否也有抗增殖作用尚不清楚。目前本實(shí)驗(yàn)室體外研究發(fā)現(xiàn)咪唑立賓能夠抑制系膜細(xì)胞增殖，下調(diào)細(xì)胞周期正調(diào)控蛋白(cyclins，CDK)的表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白(CKI)的表達(dá)。體內(nèi)是否也具有相似的作用尚未有研究。我們成功制備了急性anti-Th

3、yl腎炎大鼠模型，觀察咪唑立賓對系膜細(xì)胞增殖的影響，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。 方法： 雄性Wistar 大鼠150，只，隨機(jī)分為以下五組：(1)正常對照組(groupC)；(2)anti-Thyl腎炎模型組(groupT)；(3)Mz治療組(groupM)； (4)科素亞治療組(groupL)；(5)Mz+科素亞治療組(groupM+L)。每組30只，每組每個時間點(diǎn)5只。模型組及治療組尾靜脈注射OX-7細(xì)胞

4、上清濃縮液(1.5ml/kg相當(dāng)于蛋白100mg/kg)；正常組注射生理鹽水。造模后6小時開始灌胃給藥，連續(xù)給藥6天。以上各組大鼠分別給予生理鹽水、生理鹽水、MZ(20mg/kg/d)、科素亞(200mg/kg/d)、MZ(20mg/kg/d)+科素亞(200mg/kg/d)。于造模后第1、2、3、4、5、7天分別處死各組大鼠留取腎組織標(biāo)本，處死前一天腹膜內(nèi)注射。Brdu(100mg/kg，3次/日)，第7天處死前留取24小時尿液和血清

5、標(biāo)本用于檢測24小時尿蛋白、血尿素氮、肌酐水平；雙側(cè)腎組織用于組織學(xué)及RT-PCR及Western blot分析。 結(jié)果： 1.24h尿蛋白定量和SCr、BUN：與正常對照組相比，模型組24h尿蛋白定量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，咪唑立賓或科素亞均可降低24h尿蛋白，且咪唑立賓或聯(lián)合用藥的作用顯著優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用科素亞的作用(P<0.05)。每個時間點(diǎn)內(nèi)，各組大鼠之間SCr、BUN含量均無顯著性差異(P>0.05

6、)。 2.腎臟組織形態(tài)學(xué)變化：與正常對照組相比，模型組腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞數(shù)明顯增加，ECM積聚增多(P<0.05)；與模型組相比，咪唑立賓或科素亞均可減少腎小球內(nèi)的系膜細(xì)胞數(shù)和ECM積聚，且咪唑立賓或聯(lián)合用藥的作用顯著優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用科素亞的作用(P<0.05)。 3.RT-PCR：與正常組相比，模型組cyclin D1、cyclinA的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；咪唑立賓或科素亞均可顯著下調(diào)其表達(dá)，且咪唑立賓或聯(lián)合

7、用藥的作用顯著優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用科素亞的作用(P<0.05)。P27的mRNA表達(dá)水平各個時間點(diǎn)各組之間無顯著性差異(P>0.05)。 4.Western bolt：與正常組相比，模型組cyclin D1、cyclin A、P21及CDK2的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，P27的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；咪唑立賓或科素亞均可顯著下調(diào)cyclin D1、cyclin A、P21及CDK2的表達(dá)，上調(diào)P27的蛋白表達(dá)，且咪唑立賓或聯(lián)合用藥的作

8、用顯著優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用科素亞的作用(P<0.05)。 5.免疫熒光：Brdu標(biāo)記顯示正常組大鼠幾乎沒有Brdu陽性細(xì)胞。與正常組相比，模型組Brdu陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，咪唑立賓或科素亞均可顯著減少其表達(dá)(P<0.05)。 與正常組相比，模型組cyclin D1、cyclin A及CDK2的陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，P27陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)；與模型組相比，咪唑立賓或科素亞均可顯著減少cyclin DI、cyclin