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文檔簡(jiǎn)介
1、文章主要從以下幾方面進(jìn)行了論述。
第一部分藥學(xué)研究。
目的:提取分離大黃化學(xué)組分。
方法:采用6種型號(hào)的大孔樹脂(D101、X-5、AB-8、DM301、DM130、DA201)對(duì)大黃化學(xué)組分進(jìn)行分離,以大黃酸與大黃素含量作為指標(biāo)成分,用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)分析其分離效果。
結(jié)果:各型號(hào)的大孔樹脂分離大黃酸與大黃素的得率D101(0.2796%;0.1359%)、X-5(0.6947%;0
2、.2190%)、AB-8(0.6458%;0.3206%)、DM301(0.5839%;0.1297%)、DM130(0.7202%;0.3408%)、DA201(0.4622%;0.2337%),其中DM130得率最高,經(jīng)HPLC分析,30%、60%洗脫組成分未知,90%洗脫組為大黃游離葸醌,其主要化合物為大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素,純度為90%。
結(jié)論:經(jīng)DM130分離得到的90%乙醇洗脫組為大黃游離蒽醌,其主要成分為大黃
3、酸、大黃素、蘆薈大黃素,純度為90%,符合藥用標(biāo)準(zhǔn)。
第二部分藥理學(xué)研究。
目的:
1.模型建立:分別用高糖(30 mmol/L)及正常葡萄糖(5.56 mmol/L)培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cell,MC),觀察其對(duì)MC增殖的影響,建立高糖狀態(tài)下MC增殖病理模型。
2.大黃活性組分篩選:分別用30%、60%組分及游離蒽醌刺激高糖培養(yǎng)下的MC,觀察其對(duì)MC增殖的影響,篩選出大黃
4、中的活性組分。
3.探討大黃游離蒽醌對(duì)高糖培養(yǎng)下MC中相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用及基質(zhì)蛋白分泌的影響,探討其作用機(jī)制。
方法:
1.大黃活性組分篩選
將經(jīng)傳代的MC同步化后分組:NG組(5.56 mmol/L葡萄糖)、MA組(5.56mmol/L葡萄糖+24.44 mmol/L甘露醇)、HG組(30 mmol/L葡萄糖)、RM組(30mmol/L葡萄糖+1‰ DMSO)、30G組(0.25、0.5、1
5、、5、10、20、40μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰ DMSO)、60G組(0.25、0.5、1、5、10、20、40μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰DMSO)、FARG組(0.25、0.5、1、5、10、20、40μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰DMSO),刺激12h、24h、48 h,采用CCK-8法,用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。
2.大黃游離蒽醌對(duì)MC相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用及基質(zhì)
6、蛋白分泌的影響
將經(jīng)傳代的MC同步化后分組:NG組(5.56 mmol/L葡萄糖)、MA組(5.56mmol/L葡萄糖+24.44 mmol/L甘露醇)、HG組(30 mmol/L葡萄糖)、RM組(30mmol/L葡萄糖+1‰DMSO)、FARL組(5μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰DMSO)、FARM組(10μg/ml+30 mmol/L葡萄糖+1‰DMSO)、FARH組(20μg/ml+30mmol/L葡萄糖+1
7、‰DMSO),刺激12h、24 h、48 h,RT-PCR法檢測(cè)MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol和FN mRNA表達(dá);ELISA法檢測(cè)MC上清中TGF-β1、CTGF、ⅣCol和LN的蛋白含量。
結(jié)果:
1.大黃活性組分的篩選
1.1模型建立:與NG組比較,HG組OD值明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
1.2與Rm組比較,HG組OD值無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
8、
1.3與HG組比較,12h,30G組、60G組、FARG組OD值明顯下降,隨著時(shí)間延長(zhǎng),OD值下降更加顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中,30G組和60G組在48h,20μg/ml時(shí)OD值明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而FARG組在48 h,5μg/ml時(shí)OD值明顯下降,且隨著劑量的增加,OD值下降愈顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.大黃游離蒽醌對(duì)MC中TGF-β1、CTGF、Ⅳ
9、 Col、FN基因表達(dá)的調(diào)控作用及TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN蛋白分泌的影響
2.1模型建立:與NG組比較,HG組MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN的、基因表達(dá)及TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN蛋白分泌明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.2對(duì)MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN基因表達(dá)的調(diào)控作用:
與RM組比較,HG組MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、F
10、N的基因表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
與HG組比較,12h,F(xiàn)AR各組MC中TGF-β1基因表達(dá)有下降趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);24 h,F(xiàn)ARM、FARH組MC中TGF-β1基因表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);48 h,F(xiàn)AR各組MC中TGF-β1基因表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。12h,F(xiàn)ARM、FARH組MC中CTGF基因表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);2
11、4h,F(xiàn)AR各組MC中CTGF基因表達(dá)均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);48h,F(xiàn)ARH組MC中CTGF基因表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。12h,24 h,48 h,F(xiàn)AR各組MC中Ⅳ Col基因表達(dá)均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。12h,F(xiàn)ARM、FARH組MC中FN基因表達(dá)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24h,F(xiàn)ARH組MC中FN基因表達(dá)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);48h
12、,F(xiàn)AR各組MC中FN基因表達(dá)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
3.對(duì)MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN基質(zhì)蛋白分泌的影響
與RM組比較,HG組中MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、LN基質(zhì)蛋白的分泌,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
與HG組比較,12h,F(xiàn)AR各組MC中TGF-β1蛋白分泌有下降趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);24h,F(xiàn)AR各組MC中TGF-β1基質(zhì)
13、蛋白分泌下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);48h,F(xiàn)ARM、FARH組MC中TGF-β1蛋白分泌降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。12h、24h,F(xiàn)AR各組MC中CTGF蛋白分泌均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);48h,F(xiàn)AR各組MC中CTGF蛋白分泌有下降趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。12h,F(xiàn)ARH組MC中ⅣCol蛋白分泌降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24h,F(xiàn)ARM、FARH組MC中ⅣCo
14、l蛋白分泌降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);48h,F(xiàn)AR各組MC中ⅣCol蛋白分泌無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。12h,F(xiàn)ARM組MC中LN蛋白分泌均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24h,F(xiàn)ARL、FARM組MC中LN蛋白分泌均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);48h,F(xiàn)AR各組MC中LN蛋白分泌有下降趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論:
1.大黃活性組分篩選
15、r> 1.1高糖能顯著地促進(jìn)了MC增生,說明MC增殖模型符合實(shí)驗(yàn)要求。
1.230%、60%組分、游離蒽醌均能抑制高糖培養(yǎng)的MC增殖,但是大黃游離蒽醌的作用優(yōu)于其它兩組,且表現(xiàn)出一定的劑量和時(shí)間依賴性,因此,篩選出大黃游離蒽醌的劑量組:5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml,進(jìn)一步研究其對(duì)MC基質(zhì)分泌的影響。
2.大黃游離蒽醌對(duì)MC基質(zhì)分泌的影響
2.1與NG組比較,HG組MC中TGF-β1、CTG
16、F、Ⅳ Col、FN基因表達(dá)及TGF-β1、CTGF、Ⅳ Col、LN蛋白分泌明顯升高,說明高糖可刺激MC細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。
2.2與RM組比較,HG組MC中TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN基因表達(dá)及TGF-β1、CTGF、Ⅳ Col、LN蛋白分泌無顯著性差異,提示DMSO對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。
2.3在20μg/ml,24 h時(shí),大黃游離蒽醌能顯著抑制TGF-β1、CTGF、ⅣCol、FN的基因表達(dá)及TGF-β1
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