大鼠星形膠質細胞在突觸形成與傳遞中的作用及其可能機制的探討.pdf

1、在中樞神經系統(tǒng)中，突觸周圍一般都有星形膠質細胞的突起包繞，因此星形膠質細胞被看成是繼突觸前、后成份之后構成突觸的第三成份。這些包繞突觸的膠質細胞對突觸到底如何起作用至今知之甚少。近十幾年的研究表明，膠質細胞除起支持、分隔和營養(yǎng)作用外，還有調節(jié)神經元間的信號傳遞、神經分泌等作用，但對突觸形成及突觸可塑性作用的報告不多。膠質細胞能直接影響突觸形成的證據主要源于Pfrieger和Barres等的工作，他們發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞培養(yǎng)液能顯著增加大鼠視

2、網膜神經節(jié)細胞(RGCs)形成突觸的數(shù)量。迄今為止，在培養(yǎng)的海馬、下丘腦、脊髓及干細胞來源的神經元上也得到同樣的結果，而且發(fā)現(xiàn)外周神經系統(tǒng)施萬細胞也參與神經肌肉連接處突觸的形成和維持。但星形膠質細胞是通過何種機制影響突觸形成和可塑性的至今尚不清楚。 以往的研究已顯示，腦內固醇類物質如雌激素參與了神經系統(tǒng)的發(fā)育、性分化、生理和病理等，同時也被證明參與了部分突觸功能的調節(jié)，故被稱為“神經活性固醇(neuroactivesteroid

3、s)”。本室曾研究證明膠質細胞瘤和神經干細胞中有高活性的芳香化酶表達，芳香化酶是神經類固醇物質代謝過程中關鍵的酶，能催化雄激素轉化為雌激素，這提示星形膠質細胞可能合成雌激素。另外我們發(fā)現(xiàn)神經元中有豐富的ER-alpha和ER-beta兩種雌激素受體(ER)表達。因此推測膠質細胞合成并分泌的雌激素可能通過雌激素受體作用于神經元，激活下游信號，參與了突觸的形成與信息傳遞的調節(jié)過程。為驗證我們的假設，本實驗以純培養(yǎng)新生大鼠皮層神經元為模型，用

4、細胞培養(yǎng)、ELISA、免疫熒光技術、突觸記數(shù)、膜片鉗技術和FM4-64活體染色標記的突觸囊泡釋放實驗等方法探討星形膠質細胞(AST)是否參與突觸的形成和信息傳遞，及其可能的作用分子。我們實驗獲得的主要結果匯報如下： 1.純培養(yǎng)的星形膠質細胞能合成并分泌雌激素，而純培養(yǎng)神經元的上清液中則檢測不到雌激素 在第一部分的實驗中，我們首先對文獻報道的原代皮層膠質細胞和神經元純化和培養(yǎng)方案進行了優(yōu)化，進行了新生大鼠皮層星形膠質細胞(

5、astrocytes，AST)和神經元的純培養(yǎng)，同時用免疫細胞化學法對培養(yǎng)的AST和神經元進行了膠質纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)和神經元微管相關蛋白(microtubule-associatedprotein2，MAP2)及神經絲蛋白200(neurofilament200，NF200)的免疫組化染色，并行細胞計數(shù)，結果顯示培養(yǎng)純化后的AST和神經元的純度均可達99％以上。通過ELI

6、SA方法檢測星形膠質細胞傳代培養(yǎng)至第2h、7d、14d和21d時的星型膠質細胞條件培養(yǎng)液(astrocyte-conditionedmedium，ACM)中雌激素E2的濃度，分別為(ng/L)：0、117±21、266±22、252±27。對照組各時相點均未檢出E2。雌激素濃度在培養(yǎng)初期隨著時間的延長而增加，第14d時達到高峰，此后分泌能力有所降低，21d時仍保持較高的濃度。而純培養(yǎng)的大腦皮層神經元在2d，4d，8d和13d時的培養(yǎng)上清

7、中則未測得E2的存在。上述結果表明，后續(xù)實驗中當ACM加入純培養(yǎng)的神經元時，內源性的E2主要來源于AST，而非神經元自身產生。 2.外源性雌激素能夠基本模擬ACM(或AST)促突觸形成和增強突觸傳遞的作用在這部分實驗中，我們以純培養(yǎng)之神經元(GroupP)、與AST混合培養(yǎng)的神經元(GroupM)、加有ACM純培養(yǎng)的神經元(GroupA)及加有外源性E2的純培養(yǎng)神經元(GroupE)為研究對象(即實驗分4組)，應用突觸計數(shù)和膜片

8、鉗技術觀察了各組突觸形成的數(shù)量和微小突觸后電流(minipostsynapticcurrents，mPSCs)的幅度及頻率。其中GroupP，A，M和E的突觸數(shù)量(個/細胞)分別為：14±3，79±9，83±11，80±9；各組mPSCs的幅度與頻率依次為20.5±2pA，13±4/min；29.1±3pA，73±16/min；31.3±3pA，78±20/min；30.2±3pA，76±18/min。上述結果顯示加有ACM純培養(yǎng)的神經

9、元與AST混合培養(yǎng)的神經元具有同樣的促突觸形成和增強mPSCs的幅度及頻率的作用，兩者明顯高于純培養(yǎng)神經元形成的突觸數(shù)量和mPSCs的幅度及頻率，這表明AST促進突觸形成和傳遞的作用主要是通過旁分泌而不是直接接觸起作用的，分泌的因子溶解在ACM中通過擴散作用到達神經元引起效應。當外源性E2加入純培養(yǎng)的神經元中時，發(fā)現(xiàn)也具有促進突觸形成和傳遞的作用，且基本能夠模擬ACM和AST的效應。結合第一部分的實驗結果，我們可以這樣推理：AST促突觸

10、形成和增強mPSCs的作用主要通過分泌至ACM中的因子介導，而這個可溶性因子很有可能是AST自身分泌的雌激素E2。為進一步驗證這一假設，同時也為探討膠質源性的E2促突觸發(fā)生及傳遞作用的可能機制，我們進行了下面的實驗。 3.膠質源性的雌激素可能通過雌激素受體(estrogenreceptor，ER)介導其促突觸形成及增強突觸傳遞的作用 實驗中我們發(fā)現(xiàn)純培養(yǎng)的神經元中能夠表達ER，且免疫熒光顯示主要存在細胞核中。眾所周知，雌

11、激素引起生物學效應的主要信號通路是通過其受體ER轉導的基因機制生效(但現(xiàn)在也發(fā)現(xiàn)部分雌激素的生物學效應還通過非基因機制起作用)，如果膠質源性的E2確實是ACM促突觸發(fā)生及傳遞作用的主要分子，則應用ER阻斷劑則可以阻斷ACM的作用。因此我們在ACM加入純培養(yǎng)神經元的同時加入ER阻斷劑Tamoxifen(GroupA+T)，同時設立對照組即只加有Tamoxifen的純培養(yǎng)神經元(GroupT)和純培養(yǎng)神經元(GroupP)，結果發(fā)現(xiàn)Tamo

12、xifen加入后，加有ACM的純神經元中突觸形成的數(shù)量由79±9個顯著下降為32±3個；mPSCs的幅度與頻率均下降，分別為24.5±2pA，35±10/min。對照組GroupT的相應數(shù)據為29±3個；22.13±2pA，37±10/min，但均大于純培養(yǎng)神經元(GroupP)的相應參數(shù)?？梢钥闯瞿z質源性的E2基本是ACM促突觸發(fā)生及傳遞作用的主要分子，并且主要通過ER起作用，但有趣的是Tamoxifen并不能完全阻斷ACM的作用。最

13、后，為進一步弄清膠質源性的E2是否通過突觸前機制調節(jié)突觸的傳遞功能，我們進行了FM4-64活體標記的囊泡釋放實驗，結果表明GroupA，M和E三組囊泡釋放動力學特點基本相似，釋放的速度和徹底度明顯強于GroupP，同樣Tamoxifen能明顯抑制ACM的促囊泡釋放作用。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AST在中樞神經系統(tǒng)中除具有傳統(tǒng)的作用外，還具有促進突觸形成和傳遞的作用，這一作用主要通過AST自身合成并分泌到ACM中的E2實現(xiàn)，并通過E