星形膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥相關(guān)的神經(jīng)變性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、本文研究目的：探討星型膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥相關(guān)的神經(jīng)變性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用和對神經(jīng)元的影響。 方法： 第一部分：使用脂多糖(LPS)作用大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞30min、24h、48h和72h，分別測定星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率，細(xì)胞釋放Ca2+和活性氧(ROS)的變化及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO、TNF．Q分泌量，細(xì)胞內(nèi)GPx活力和GSH含量變化；免疫印跡法和熒光免疫雙標(biāo)記法共同檢測細(xì)胞內(nèi)GFAP和HO．1的表達(dá)情況，以及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF—

2、KBp65和p38、JNK和ERK的磷酸化表達(dá)情況。 第二部分：將LPS作用24h以上的星型膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)液(ACM)作用PCI2細(xì)胞24h，分別檢測PCI2細(xì)胞存活率，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活力和TNF．Q分泌量，AnnexinV-PI聯(lián)合標(biāo)記檢測PCI2細(xì)胞早期凋亡率變化，免疫印跡法檢測PCI2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF．KBp65和p38、JNK和ERK的磷酸化表達(dá)情況。提前加入淫羊藿甙、齊墩果酸、喜樹堿、梔子甙和4

3、,6,7-三羥基-1，3-二甲氧基口山酮1h后再加入ACM繼續(xù)作用24h，并設(shè)LPS陽性對照組，觀察指標(biāo)同上。 結(jié)果： 第一部分：1．LPS促進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞存活率(P<0．05vscontr01)。2．LPS刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放NO增多(P<0．05vscontr01)。3．LPS各劑量組均可分別在15-30s和300-400s左右引起胞內(nèi)Ca2+度和ROS水平明顯升高。4．各時(shí)間組中，只有72h組星型膠質(zhì)

4、細(xì)胞的GSH-Px活力和GSH含量降低(P<0．05vscontr01)。5．LPSlOug／mi作用星形膠質(zhì)細(xì)胞使TNF-α的分泌量隨時(shí)間延長而增加(P<0．05vscontr01)。提前加入NF．KB阻斷劑SN50和MAPK阻斷劑PD98059均可阻止LPS引起的TNF-α含量升高(P>0．05vscontr01)。6．LPSlOμg/ml刺激AC24h后，GFAP表達(dá)增加，持續(xù)至少72h。HO-1在24h組有表達(dá)，并持續(xù)增強(qiáng)到72

5、h。GFAP和HO．1熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示HO．1和GFAP共表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)。7．NF．KBp65在AC空白對照組表達(dá)較少，30min組表達(dá)增多，從24h開始表達(dá)減弱。p-p38在24h組表達(dá)最強(qiáng)，48h組和72h組的表達(dá)均減弱。p-JNKl／2在30min組、24h組和48h組有表達(dá)并在48h達(dá)到高峰。p-ERKl／2在AC各組均有表達(dá)，其中空白對照組表達(dá)最強(qiáng)。細(xì)胞免疫熒光染色顯示，LPS刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞30min后，細(xì)胞的

6、胞核變大，胞漿豐富，突起明顯。 第二部分：1．ACM組PCI2的細(xì)胞存活率明顯下降(P<0．05vscontr01)。提前l(fā)h加入藥物淫羊霍甙(icariin)、齊墩果酸(OA)、喜樹堿(CPT)、梔子甙(gardenoside)和4,6,7-三羥基．1，3．二甲氧基口山酮(TDX)均可防止PCI2細(xì)胞死亡(P>0．05vscontr01)，并且5個化合物均不影響PCI2細(xì)胞存活率(P>0．05vscontr01)。2．ACM組

7、細(xì)胞上清液中LDH活力明顯升高(P<0．05vscontr01)，icariin+ACM組、OA+ACM組、CPT+ACM組、gardenoside+ACM組和TDX+ACM組的LDH活力與對照組相比無顯著性差異(P>0．05vscontr01)。3．ACM組細(xì)胞早期凋亡百分率顯著增加(P<0．01vscontr01)，LPS組細(xì)胞早期凋亡百分率與空白對照組相比無顯著性差異(P>0．05)，而提前加入5種植物提取化合物均可降低ACM引起

8、的PCI2早期凋亡(P<0．01vsACMgroup)。4．ACM組的TNF．Q含量增加(P<0．01vscontr01)。藥物icariin、OA、CPT、Gardenoside和TDX均可抑制ACM引起的TNF．Q含量升高(P>0．05vscontrol，P<0．05vsACMgroup)。LPS不增加PCI2TNF．Q分泌量(P>0．05vscontr01)。5．NF．KBp65在PCI2各組均有表達(dá)，無明顯差異；p-p38在AC

9、M組和LPS組表達(dá)水平較空白對照組高，在5個藥物組的表達(dá)均弱于空白對照組；p-JNKl／2在ACM組和LPS組均有表達(dá)，其中ACM組表達(dá)強(qiáng)于空白對照組和LPS組，在5個藥物組均無表達(dá)；p-ERKl／2僅在LPS組有少量表達(dá)。 結(jié)論： 1．LPS作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞可引起細(xì)胞增殖，同時(shí)釋放自由基和炎癥因子增加，細(xì)胞抗氧化能力下降； 2．LPS作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞可上調(diào)其應(yīng)激蛋白HO-1的表達(dá)，與細(xì)胞內(nèi)GFAP的表達(dá)趨勢

10、相一致； 3．LPS引起星形膠質(zhì)細(xì)胞以上變化的內(nèi)在分子機(jī)制與轉(zhuǎn)錄因子NF．KBp65表達(dá)和p38、JNK磷酸化激活有關(guān)； 4．ACM可引起PCI2細(xì)胞的損傷，早期凋亡率增加和TNF．Q分泌量增高，提示在炎癥相關(guān)神經(jīng)變性疾病中，星形膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子對神經(jīng)元主要起到損傷作用，其內(nèi)在分子機(jī)制與p38、JNK磷酸化激活有關(guān)； 5．淫羊藿甙、齊墩果酸、喜樹堿、梔子甙和4,6,7-三羥基．1，3．二甲氧基口山酮均可防