CD81在星形膠質(zhì)細胞接觸抑制中的作用機制初探.pdf

1、接觸抑制現(xiàn)象具有重要的生理意義，其與機體內(nèi)器官、組織的形態(tài)、大小以及各類細胞數(shù)量的控制有著密切的關(guān)系。機體的組織器官生長到一定程度后會自然停止生長，而不是無限制的長大；在體外培養(yǎng)過程中，當(dāng)細胞分裂增殖到一定程度，達到相互接觸時，細胞停止分裂。一般認(rèn)為，接觸抑制是由于細胞數(shù)量的增加消耗了局部區(qū)域的促分裂因子；另一方面是細胞接觸時自身分泌了一些細胞增殖的抑制因子。但Nakatsuji Y和HM.Robert的研究表明：星形膠質(zhì)細胞的接觸抑制

2、不是由可溶性因子所引起，而是由星形膠質(zhì)細胞間的相互接觸誘發(fā)了增殖抑制機制所引起的。目前接觸抑制的機制不甚清楚。為了研究接觸抑制的原理，我們以星形膠質(zhì)細胞做為模型細胞，研究了接觸抑制的可能機制，并探討了CD81在其中的可能作用。
　　 本研究共分三部分。第一部分為了觀察引起星形膠質(zhì)細胞接觸抑制的作用究竟是由于細胞自身分泌了一些細胞增殖的抑制因子，還是由于細胞相互接觸而引起的，本研究將純化的星形膠質(zhì)細胞分三組，在細胞處于低匯合，半?yún)R

3、合，完全匯合時加入接觸抑制條件培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20h后，以MTT法檢測細胞數(shù)、以流式細胞儀檢測細胞周期時相細胞指數(shù)并進行統(tǒng)計學(xué)分析。條件培養(yǎng)基沒有抑制星形膠質(zhì)細胞的增殖，對其細胞周期也無明顯影響。結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細胞的接觸抑制不是由于星形膠質(zhì)細胞接觸時釋放的可溶性因子引起的，而是由星形膠質(zhì)細胞間的相互接觸誘發(fā)了增殖抑制機制所引起的。并進一步觀察將處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細胞分離去接觸化，觀察細胞是否再次進入增殖狀態(tài)，以及匯合后是否又進入抑

4、制狀態(tài)。我們將處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細胞分離，再培養(yǎng)，當(dāng)細胞將至低匯合、半?yún)R合和全匯合時加入BrdU，繼續(xù)培養(yǎng)6h后收集細胞，與結(jié)合有FITC的抗BrdU抗體共孵育，然后通過流式細胞儀檢測細胞周期和細胞的BrdU陽性率。結(jié)果顯示：處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細胞分離、再培養(yǎng)，細胞處于低匯合和半?yún)R合狀態(tài)時，細胞增殖率再次增高。當(dāng)細胞全匯合處于接觸狀態(tài)時，細胞增殖率明顯下降。表明：處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細胞分離去接觸后，細胞又恢復(fù)了增殖能力。而再

5、次相互接觸時，細胞增殖又受到抑制。
　　 CD81分子，即抗增生抗體識別的靶抗原(Target of the Antiproliferative Antibody-1，TAPA-1)，它是一種分子量為26KD的非糖基化膜蛋白,屬干四跨膜區(qū)蛋白（tetraspanin）超家族成員,含有4個跨膜轉(zhuǎn)膜區(qū)和2個胞外區(qū),廣泛分布在各種組織和細胞的表面,可影響細胞的粘附、激活、增殖和分化,有改變細胞形態(tài)、抑制合胞體形成等生物學(xué)功能。Sull

6、ivan等人研究發(fā)現(xiàn)未成熟的星形膠質(zhì)細胞不表達或低表達CD81，隨著星形膠質(zhì)細胞的逐漸成熟，CD81的表達也逐漸增強，逐步達到成年水平。CD81對細胞的增殖具有調(diào)節(jié)的作用，并且在不同的細胞發(fā)揮的作用不同。
　　 因此第二部分研究了抗CD81抗體對處于不同狀態(tài)的純化培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞增殖抑制的影響。將純化的星形膠質(zhì)細胞分三組，在細胞處于低匯合，半?yún)R合，完全匯合時加入抗CD81抗體（4μg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)18小時后收集細胞，以MT

7、T比色法和流式細胞術(shù)觀察抗CD81抗體對處于不同狀態(tài)星形膠質(zhì)細胞的影響并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明與對照組相比，抗CD81抗體對處于低匯合，半?yún)R合的星形膠質(zhì)細胞有明顯抑制作用，其抑制率分別為15.56%和34.44%，對處于完全匯合狀態(tài)的星形膠質(zhì)細胞有輕微抑制作用，其抑制率為9.62%。因此抗CD81抗體對處于低匯合和半?yún)R合的星形膠質(zhì)細胞均有顯著抑制作用，對已經(jīng)處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細胞只有輕微抑制作用。
　　 為了進一步研究抗C

8、D81抗體對星形膠質(zhì)細胞抑制作用的時效關(guān)系，第三部分研究了抗CD81抗體作用不同時間后對星形膠質(zhì)細胞增殖抑制的作用。將純化的星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)12小時后，加入抗CD81抗體（4μg/ml），分別作用18小時，32小時及96小時后，以MTT比色法檢測星形膠質(zhì)細胞的細胞活性，計算抑制率；以流式細胞儀檢測細胞周期時相。MTT法檢測結(jié)果表明與對照組相比，抗CD81抗體作用18小時，32小時及96小時后均對星形膠質(zhì)細胞有顯著抑制作用，其抑制率分別為

9、11.17％，13.17％，27.49％。流式檢測結(jié)果表明抗CD81抗體作用18小時后，S期細胞指數(shù)與對照組相比，增加了16.09，星形膠質(zhì)細胞主要被阻滯于S期；作用32小時后，G0/G1期細胞指數(shù)與對照組相比增加了3.08；96小時后，細胞指數(shù)與對照組相比增加了5.87，細胞主要滯留于G0/G1期，即抗CD81抗體作用不同時間后均對星形膠質(zhì)細胞有顯著抑制作用，抑制作用隨時間增加而增強。早期抗CD81抗體使星形膠質(zhì)細胞阻滯于S期，隨著作

10、用時間的延長，逐漸使細胞阻滯于G0/G1期。
　　 結(jié)論：星形膠質(zhì)細胞的接觸抑制不是由可溶性因子所引起，而是由星形膠質(zhì)細胞間的相互接觸誘發(fā)了增殖抑制機制所引起的。處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細胞分離去接觸后，細胞又恢復(fù)了增殖能力。而再次相互接觸時，細胞增殖又受到抑制?？笴D81抗體對處于低匯合和半?yún)R合的星形膠質(zhì)細胞均有顯著抑制作用，對已經(jīng)處于接觸抑制的星形膠質(zhì)細胞只有輕微抑制作用?？笴D81抗體作用不同時間后均對星形膠質(zhì)細胞有顯著抑制