人永生化成骨細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中印跡基因表達(dá)譜的初步研究.pdf

1、骨肉瘤是骨的最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，多發(fā)生于青少年，惡性程度高。其特點(diǎn)是瘤細(xì)胞直接形成骨樣基質(zhì)，因此成骨細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化與骨肉瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)長期的、多階段、多基因改變積累的過程，具有多基因控制和多因素調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，而體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化是反映體內(nèi)多階段腫瘤發(fā)生過程的良好細(xì)胞模型，與體內(nèi)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有較好的相關(guān)性。體外細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)旨在揭示某一類腫瘤在其發(fā)生、發(fā)展的各階段，究竟有哪些基因發(fā)生了改變，以及以何種方式起作

2、用，即找到該腫瘤癌基因譜(genespectrum)，以期為該腫瘤的診斷及防治提供理論依據(jù)。 基因印跡指的是某些基因呈不遵從孟德爾定律的親源依賴性單等位基因表達(dá)，其另一等位基因不表達(dá)或表達(dá)極弱，具有這種現(xiàn)象的基因被稱為印跡基因。印跡的腫瘤相關(guān)基因?yàn)閱蔚任换虮磉_(dá)，相當(dāng)于功能上的單倍體，僅需一次突變就使該基因失活，因而更易發(fā)生腫瘤，增加了腫瘤的易感性。以往有關(guān)的研究多以單個(gè)或幾個(gè)印跡基因?yàn)閷ο螅@結(jié)果雖有意義但對于認(rèn)識腫瘤發(fā)生發(fā)

3、展這樣的復(fù)雜問題仍顯不足。大量印跡基因在腫瘤發(fā)生中的參與環(huán)節(jié)仍有待進(jìn)一步明確。因此探討腫瘤細(xì)胞各種印跡基因的表達(dá)的改變對惡性腫瘤的防治有重要意義。為初步探討在骨肉瘤發(fā)生過程中印跡基因群的表達(dá)改變，我們擬分兩部分進(jìn)行本課題，第一部分為建立人永生化成骨細(xì)胞hFOB1.19兩階段轉(zhuǎn)化模型：我們采用化學(xué)致癌物N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)作為轉(zhuǎn)化人永生化hFOB1.19細(xì)胞的啟動劑，培養(yǎng)傳代后加入促癌物佛波酯(TPA)誘導(dǎo)其惡性

4、轉(zhuǎn)化，并檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遺傳學(xué)及生物學(xué)特性；第二部分是對人永生化hFOB1.19細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中印跡基因表達(dá)譜改變的研究：實(shí)驗(yàn)中我們收集了轉(zhuǎn)化過程中5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，運(yùn)用具有高通量平行處理特點(diǎn)的基因芯片技術(shù)對收集細(xì)胞的印跡基因表達(dá)譜進(jìn)行分析。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 一、人永生化成骨細(xì)胞hFOB1.19兩階段惡性轉(zhuǎn)化模型的建立 1.用1μgmlMNNG為啟動劑，200ng/mlTPA為促癌劑處理人永生化hFOB1

5、.19細(xì)胞，獲得惡性轉(zhuǎn)化的成骨細(xì)胞。 2.實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)化的hFOB1.19細(xì)胞DNA含量明顯增高；細(xì)胞染色體出現(xiàn)異倍體化；數(shù)量明顯增加；細(xì)胞能在軟瓊脂中生長，具有錨著不依賴生長特性；轉(zhuǎn)化細(xì)胞可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)侵襲生長形成骨源性惡性腫瘤。 二、人永生化hFOB1.19細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中印跡基因表達(dá)譜改變的初步分析 1.采用寡核苷酸基因芯片檢測人永生化成骨細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0d，40d，55d，70d，9

6、0d)的印跡相關(guān)基因表達(dá)變化，共篩選出10個(gè)差異表達(dá)的印跡基因(Ratio≥2或≤0.5)，功能分類顯示這些差異表達(dá)的印跡基因主要與細(xì)胞生長/維持和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。 2.CD81、GRB10、NDN在轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)呈下降趨勢，H19、MKRN3在轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)呈增加趨勢，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，這些印跡基因可能與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。 3.MEST在轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)呈下降趨勢，SLC22AlL、TSSC3、CDKNlC在轉(zhuǎn)