鹽酸克倫特羅（瘦肉精）的毒性作用及其在動物體內(nèi)含量的測定.pdf

1、鹽酸克倫特羅(clenbuterol，簡稱CLB)，又名瘦肉精，化學(xué)名為α-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇，是一種從天然兒茶酚胺衍生合成的化合物。臨床上常用其鹽酸鹽—鹽酸克倫特羅，為白色結(jié)晶粉末，無臭、味微苦，溶于水，是β2腎上腺受體激動劑。 1984年，美國研究人員意外發(fā)現(xiàn)鹽酸克倫特羅具有明顯的促進生長、提高瘦肉率及減少脂肪率的效果，可以使畜禽胴體瘦肉率增加10％以上。機理主要是CLB可通過腎上腺素刺激腺苷

2、酸環(huán)化酶的合成，從而升高環(huán)腺苷酸(cAMP)的濃度，提高激素敏感脂酶的活性，加快脂肪分解，相應(yīng)增加了血液中游離脂肪酸進入肌肉的含量，進一步為蛋白質(zhì)的合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)；同時，瘦肉精作為一種植物性神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，可降低血液中抑制肌肉興奮性的Mg2+濃度，間接促進肌肉興奮，改變細胞膜的通透性，參與機體內(nèi)的代謝調(diào)控及營養(yǎng)重分配——抑制蛋白質(zhì)的分解和脂肪的合成，進而增加氮的組織沉積[1]。 此后，CLB被廣泛應(yīng)用到畜禽生產(chǎn)中。但隨后國內(nèi)外發(fā)生

3、多起食用CLB殘留畜肉中毒事件后，CLB已被各國禁止作為生長促進劑使用。我國農(nóng)業(yè)部也禁止CLB作為飼料添加劑使用，但一些不法商販在利益的驅(qū)使下仍然在違法使用，因食用CLB殘留畜肉引起的中毒事件每年也都有報道。針對CLB被認為可以提高運動成績而被濫用，研究者經(jīng)動物試驗后報道說，長期使用CLB不但不能提高運動成績，反而會降低運動成績。關(guān)于其機理也有許多報道[2-6]。目前，國際奧林匹克委員會醫(yī)學(xué)委員會和有關(guān)國家體育組織已將克倫特羅列為禁止使

4、用的興奮劑。由于CLB具有比其它肌肉增強劑更快的肌肉增強作用，因此CLB仍然被一些運動員濫用，由此而造成的對人體的長期危害由于不像急性中毒那樣明顯，更容易被人所忽略。 關(guān)于CLB的急性毒性作用國內(nèi)外已有詳盡報道，在長期毒性研究方面，Burniston[26]觀察到長期使用大劑量的CLB會造成部分心肌和比目魚肌的肌球蛋白抗體的升高，從而造成部分心肌和比目魚肌的壞死，但心肌的壞死并不是很一致。國外還有報道CLB具有生殖內(nèi)分泌毒性，最

5、具代表性的為子宮和陰道中粘液2的不正常收集，伴隨微囊卵巢和子宮內(nèi)膜顯著擴張，同時觀察到子宮雌激素受體和孕激素受體顯著增加[9]。長期服用能夠影響合成代謝劑量的CLB導(dǎo)致腎上腺分泌功能過度，造成腎上腺及腎臟皮質(zhì)增生，這將對機體產(chǎn)生不利影響[10]，提高了對應(yīng)激的敏感性。此外，還有關(guān)于其肝臟毒性研究的報道，Goimerac[28]報道長期使用CLB能造成肝臟ALT、AP等指標的升高，并造成細胞的損害，影響其功能。關(guān)于CLB長期應(yīng)用是否有致突

6、變、致癌作用還沒有詳細的報道，有文章稱CLB長期應(yīng)用可能有致癌作用，但沒有直接的證據(jù)。本研究將應(yīng)用免疫組化及流式細胞技術(shù)，通過對PCNA、BCL-2等免疫學(xué)指標的檢測，觀察CLB長期應(yīng)用對殘留量較高的一些動物器官的危害，進一步找出CLB長期使用對人體的可能危害。并尋找一種簡便，快捷的CLB殘留檢測方法以及測定CLB在動物體內(nèi)的殘留量。 研究目的在小鼠急性經(jīng)口毒性、蓄積毒性和致突變毒性的基礎(chǔ)上對小鼠進行長期染毒，觀察CLB對小鼠體

7、重、血液生化指標的影響并應(yīng)用免疫組化及流式細胞技術(shù)，通過對PCNA、BCL-2等免疫學(xué)指標的檢測，研究CLB長期應(yīng)用對殘留量較高的一些動物器官的危害，進一步找出CLB長期使用對人體的可能危害。應(yīng)用ELISA法，通過CLB酶聯(lián)免疫試劑盒檢測動物尿液、肌肉、肝臟的殘留以尋找一種簡便，快捷的CLB殘留檢測方法并測定CLB在動物體內(nèi)的殘留量。 研究方法急性經(jīng)口毒性采用霍恩氏法測定CLB對大小鼠的LD50并觀察主要中毒癥狀；劑量遞增法測定

8、CLB的蓄積毒性；小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗和小鼠初級精母細胞染色體畸變試驗測定CLB的致突變毒性；亞慢性毒性試驗對小鼠進行為期三個月的染毒，試驗結(jié)束后觀察小鼠體重、臟器系數(shù)、血常規(guī)、生化常規(guī)指標并進行病理組織學(xué)檢查；亞慢性毒性試驗結(jié)束后取小鼠的主要臟器采用免疫組化技術(shù)測定組織中PCNA、BCL-2指標的變化，并采用流式細胞技術(shù)測量其主要臟器的細胞周期變化；采用ELISA法，用CLB酶聯(lián)免疫試劑盒測定CLB在小鼠尿液、肌肉、肝臟中的殘留

9、。 研究結(jié)果1.短期毒性動物急性中毒癥狀主要為呼吸困難、心動過速、強直性陣攣性抽搐、昏迷等癥狀，大鼠急性經(jīng)口LD50雌雄動物均為147mg/kg，小鼠急性經(jīng)口LD50雌雄動物均為126mg/kg。 蓄積毒性試驗期間，動物飲食活動正常，體重增長良好，未見動物有異常表現(xiàn)或中毒癥狀，至灌胃結(jié)束，動物無死亡發(fā)生，蓄積系數(shù)K=5.26，屬輕度蓄積3性藥物。 小鼠骨髓多染紅細胞微核試驗和小鼠初級精母細胞染色體畸變試驗均表明：

10、CLB無明顯致突變作用。 2.亞慢性毒性試驗大鼠CLB經(jīng)口給藥3個月亞慢性毒性試驗結(jié)果顯示：2.1體重變化：各劑量給藥組大鼠體重均低于陰性對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05). 2.2臟器系數(shù)變化：各劑量組大鼠與陰性對照組比較臟器系數(shù)均無明顯變化。 2.3血常規(guī)指標：各劑量組大鼠與陰性對照組比較血常規(guī)指標均無明顯變化。 2.4生化指標：大劑量組動物谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)與陰性對照

11、組比較有顯著性差異(p＜0.05)，提示大劑量組大鼠肝臟受到損害。大劑量組尿素氮(BUN)與陰性對照組比較有顯著性差異(p＜0.05)，提示大劑量組大鼠腎臟受到損害。堿性磷酸酶(ALP)、肌酐(Cre)、血糖(GLU)、白蛋白(ALB)各指標給藥組與陰性對照組比較差異無顯著性(p＞0.05)。常規(guī)病理切片顯示肝臟有點狀出血，間質(zhì)炎癥及細胞水腫，邊緣有壞死，腎臟有片狀出血及少量細胞壞死。 3.免疫組化實驗對大鼠經(jīng)口給藥3個月后，取

12、其心、肝、肺、腎等組織，對其PCNA、BCL-2等指標用LSAB法進行免疫組化研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：腎臟組織PCNA、BCL-2指標表達均較強，大劑量組與陰性對照組比較差異有顯著性(p＜0.05)，其他各組織表達較弱。說明：CLB能使動物的細胞增殖增強并抑制其凋亡。 4.流式細胞儀檢測大鼠經(jīng)口給藥3個月后取其心、肝、肺、腎等組織，做成單細胞懸液，流式細胞儀檢測其細胞周期，發(fā)現(xiàn)：大劑量組腎組織細胞的凋亡指數(shù)明顯低于對照組，差異有顯著性(

13、p＜0.05)，其他各動物組織與對照組比較差異無顯著性。 5.ELISA法檢測CLB在動物尿及肝臟、肌肉組織中的殘留含量為期20天的蓄積毒性實驗結(jié)束后，取動物尿及肝臟、肌肉組織，經(jīng)前處理后，用酶聯(lián)免疫試劑盒測定，用酶標儀測定其吸光度，根據(jù)標準品和樣品的吸光度值做出標準曲線，樣品濃度從標準曲線上讀出。CLB濃度由高到低分別為：尿＞肝臟＞肌肉。 CLB在動物中殘留為：尿液810ng/g,肝臟490ng/g,肌肉32ng/g.