氟達(dá)拉濱對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞殺傷作用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是漿細(xì)胞異常增生的惡性血液病,骨髓內(nèi)有異常漿細(xì)胞增殖,引起骨骼破壞,血清出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白,最后導(dǎo)致貧血和腎功能損害。雖經(jīng)聯(lián)合化療、大劑量化療等取得一定療效,但最終都不可避免產(chǎn)生耐藥。目前,多發(fā)性骨髓瘤仍然是不可治愈的疾病。氟達(dá)拉濱(Fludarabine)是腺嘌呤核苷酸類似物,其代謝產(chǎn)物(F-ara-ATP)主要通過抑制核糖核酸還原酶、DNA聚合酶、DNA引物酶和DNA連接酶的活

2、性從而抑制DNA的合成,在一些細(xì)胞株,還可以通過與RNA結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄。氟達(dá)拉濱目前已應(yīng)用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤,但氟達(dá)拉濱對多發(fā)性骨髓瘤的作用及其機(jī)制的報道很少,本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)和體外兩個方面研究氟達(dá)拉濱對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的影響,并試圖從多個方面來探討其作用機(jī)制。首先采用MTT比色法檢測,結(jié)果顯示:經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)濃度的氟達(dá)拉濱處理24、48h后,RPMI8226細(xì)胞的增殖在24h時抑制很明顯,其半數(shù)抑制濃度(IC50)是2.129μg/ml,MM

3、.1S和MM.1R48h的IC50分別是13.48μg/ml、33.79μg/ml,而U266對氟達(dá)拉濱耐藥。IL-6及其信號途徑是骨髓瘤細(xì)胞生長和耐藥的主要機(jī)制,我們研究了體外IL-6對氟達(dá)拉濱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示:外源性IL-6(50ng/ml)不能阻斷氟達(dá)拉濱誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞的凋亡。同時我們又聯(lián)用了氟達(dá)拉濱和地塞米松,結(jié)果顯示氟達(dá)拉濱可明顯提高地塞米松對MM.1S的細(xì)胞毒作用。為探討氟達(dá)拉濱對MM細(xì)胞株抑制作用的機(jī)

4、制,我們從細(xì)胞凋亡及細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑二個層面作了進(jìn)一步的研究。為了對細(xì)胞抑制現(xiàn)象進(jìn)行準(zhǔn)確地定性或定量分析,我們采用流式細(xì)胞分析技術(shù)研究了磷脂酰絲氨酸(PS)轉(zhuǎn)位、細(xì)胞亞G1峰、細(xì)胞周期改變,還通過TUNEL法來研究細(xì)胞的晚期凋亡。PI染色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示:2μg/ml氟達(dá)拉濱作用于RPMI8226細(xì)胞6,12,24小時,出現(xiàn)G0/G1期的捕獲,S期細(xì)胞的減少,同時亞二倍體凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為8.84％,17.05%,26.88%,

5、明顯高于空白對照1.63%,說明氟達(dá)拉濱對RPMI8226細(xì)胞增殖的抑制不僅與細(xì)胞周期捕獲有關(guān),還與細(xì)胞凋亡有關(guān)。我們進(jìn)一步用AnnexinV-PI雙標(biāo)記法流式細(xì)胞儀分析,結(jié)果顯示:RPMI8226細(xì)胞經(jīng)1-4μg/ml氟達(dá)拉濱作用24h,藥物處理組的凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為8.84%,12.25%,21.71%,63.28%,65.94%,明顯高于空白對照組4.13%。TUNEL結(jié)果也顯示:隨著氟達(dá)拉濱作用時間的延長,TUNEL陽性細(xì)胞率

6、明顯增加,呈時間依賴性。為探討氟達(dá)拉濱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能途徑,用Western-blot檢測氟達(dá)拉濱對RPMI8226細(xì)胞caspase-8,-9,-7,-3和PARP蛋白的活性變化。結(jié)果顯示:2μg/ml氟達(dá)拉濱作用于細(xì)胞6h、12h、24h,可見明顯的caspase-8,-9,-7,-3和PARP蛋白的激活帶。我們進(jìn)一步研究了內(nèi)源性途徑在氟達(dá)拉濱誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞凋亡的作用,結(jié)果顯示:隨著藥物作用時間的延長,線粒體膜電位明顯下

7、降,胞漿內(nèi)Smac蛋白明顯上升，bid蛋白明顯下降,bax蛋白明顯上升。本實(shí)驗(yàn)還通過Western-blot檢測氟達(dá)拉濱對MM細(xì)胞株Akt、IAPs蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:2μg/ml氟達(dá)拉濱作用于RPMI8226細(xì)胞6h、12h、24h,可見Survivin、XIAP蛋白的表達(dá)明顯下降,而cIAP蛋白的表達(dá)沒有明顯的變化。2μh/ml氟達(dá)拉濱作用于四種MM細(xì)胞株24h,Survivin表達(dá)在RPMI8226、MM.1R、MM.1S中

8、都有不同程度的下降,而在U266細(xì)胞中的表達(dá)沒有變化。我們進(jìn)一步研究了磷酸化Akt(p-Akt)在MM細(xì)胞株中的表達(dá),結(jié)果表明:RPMI8226,MM.1S,MM.1R細(xì)胞的p-Akt表達(dá)較高,表達(dá)最低的是U266。2μg/ml氟達(dá)拉濱作用于四種MM細(xì)胞株24h,僅部分細(xì)胞的p-Akt表達(dá)下降。我們進(jìn)一步評價了Akt在氟達(dá)拉濱誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡中的作用,在p-Akt表達(dá)高的細(xì)胞,Akt抑制劑LY294002可誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞凋亡,同時與氟達(dá)

9、拉濱聯(lián)用有輕微的協(xié)同作用。為了進(jìn)一步證實(shí)氟達(dá)拉濱對MM的抗腫瘤作用,我們用氟達(dá)拉濱治療RPMI8226植入腫瘤小鼠模型。動物實(shí)驗(yàn)顯示:在荷瘤動物,氟達(dá)拉濱能使腫瘤顯著縮小,與對照組相比,有顯著差異。免疫組化結(jié)果顯示:氟達(dá)拉濱的抗骨髓瘤作用與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　小結(jié):
　　(1)氟達(dá)拉濱可直接抑制RPMI8226、MM.1R、MM.1S細(xì)胞,并呈濃度依賴性,這種抑制作用不能被IL-6所阻斷。
　　(2)氟達(dá)拉濱可明

10、顯提高地塞米松對MM.1S的細(xì)胞毒作用。
　　(3)氟達(dá)拉濱處理一定時間后可明顯地誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞凋亡,呈濃度時間依賴性。
　　(4)氟達(dá)拉濱誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡機(jī)理:
　?、賰?nèi)源性和外源性caspase途徑激活,具體表現(xiàn)為caspase-8,-9,-7,-3和PARP蛋白的激活;
　?、赽id蛋白明顯下降,bax蛋白明顯上升，胞漿內(nèi)Smac蛋白明顯上升;
　?、跾urvivin蛋白的表達(dá)明顯下調(diào);