仿去上皮羊膜微納結(jié)構(gòu)殼聚糖改性膠原—透明質(zhì)酸復(fù)合電紡膜的研制及其性能研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了闡述。
　　第一部分仿去上皮羊膜微納結(jié)構(gòu)殼聚糖改性膠原-透明質(zhì)酸復(fù)合電紡膜的研制。
　　目的:利用高壓靜電紡絲與靜電吸附表面改性技術(shù)探討制備仿去上皮人羊膜超微結(jié)構(gòu)殼聚糖改性膠原-透明質(zhì)酸復(fù)合電紡膜的可行性，獲得膠原以乙酸為溶劑制備納米纖維以及在聚環(huán)氧乙烷為促電紡劑下膠原復(fù)合透明質(zhì)酸制備納米纖維的最佳濃度配比，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合交聯(lián)和靜電吸附表面改性技術(shù)優(yōu)化復(fù)合電紡膜的穩(wěn)定性與表面微納結(jié)構(gòu)，以期為眼表損傷修復(fù)

2、用覆膜的研究提供實(shí)驗基礎(chǔ)，拓寬靜電紡絲納米技術(shù)和靜電吸附表面改性技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。
　　方法:首先對人羊膜組織微觀形貌進(jìn)行細(xì)致觀察分析，在此基礎(chǔ)上，采用具有良好生物相容性的天然高分子材料膠原、透明質(zhì)酸和人工合成高分子材料聚環(huán)氧乙烷為主要的研究原料，通過對電紡原材料濃度配比的調(diào)整，優(yōu)化靜電紡絲各項參數(shù)，制備復(fù)合電紡薄膜。通過戊二醛交聯(lián)和透明質(zhì)酸與殼聚糖靜電吸附作用，改善電紡薄膜的穩(wěn)定性和微納結(jié)構(gòu)，肉眼觀察評估所制備的復(fù)合

3、電紡膜的透明性和可操作性，掃描電鏡檢測薄膜表面和斷面微結(jié)構(gòu)，分析評價殼聚糖改性膠原-透明質(zhì)酸復(fù)合電紡膜與去上皮人羊膜組織在微觀形貌上的相似性。
　　結(jié)果:去上皮人羊膜基底膜和基質(zhì)是由平均直徑分別為52.9±17.5nm和41.2±14.7nm的膠原纖維無規(guī)則排列組成的片層結(jié)構(gòu)。在25℃，40％濕度環(huán)境中，推進(jìn)速度為0.1ml/h，接收距離為10cm，電壓在10-15KV之間時，電紡處于穩(wěn)定狀態(tài)。10％w/v膠原以90％v/v乙酸為

4、溶劑電紡可以制備平均直徑為79.1±27.8nm的纖維薄膜;10％w/vCOL、0.1％w/vHA和7％w/vPEO以8∶1∶1體積比電紡可以制備平均直徑為106.6±40.9nm，表面光滑，具有良好分散性的納米纖維薄膜。戊二醛交聯(lián)不僅使復(fù)合電紡膜納米纖維形態(tài)和直徑（平均直徑為66.3±24.8nm）更接近于羊膜基底膜和基質(zhì)，而且大大改善了薄膜的透明性和可操作性;在不影響復(fù)合膜纖維形態(tài)和直徑前提下復(fù)合膜實(shí)現(xiàn)殼聚糖表面改性并與去上皮人羊膜

5、微觀形貌更加相近。
　　結(jié)論:本研究首先證實(shí)了膠原、透明質(zhì)酸復(fù)合聚環(huán)氧乙烷電紡制備具有納米級直徑均一纖維薄膜的可行性;并在此基礎(chǔ)上，通過戊二醛交聯(lián)和靜電吸附表面改性方法對復(fù)合薄膜透明性和可操作性進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了對去上皮人羊膜組織微納結(jié)構(gòu)的人工模擬，為臨床眼表損傷修復(fù)用眼表覆膜的研究和應(yīng)用奠定了可靠的實(shí)驗基礎(chǔ)。
　　第二部分仿去上皮羊膜微納結(jié)構(gòu)殼聚糖改性膠原透明質(zhì)酸復(fù)合電紡膜的物理化學(xué)性能研究。
　　目的:對膠原-透明質(zhì)

6、酸復(fù)合電紡膜、交聯(lián)膜和殼聚糖改性膜的物理化學(xué)性能進(jìn)行表征，探討交聯(lián)和表面改性后處理對薄膜理化性能的影響，對比分析殼聚糖改性膠原-透明質(zhì)酸復(fù)合電紡膜與去上皮人羊膜組織相應(yīng)性能的差異，為進(jìn)一步優(yōu)化該類眼表修復(fù)覆膜研究奠定實(shí)驗基礎(chǔ)，同時也為臨床上眼表組織修復(fù)支架的制備提供新的方法和研究思路。
　　方法:采用紫外-可見光光度儀對不同薄膜的可見光透過率進(jìn)行檢測，傅里葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析不同薄膜的化學(xué)組成及變化，萬能測試機(jī)對薄膜的抗拉強(qiáng)度、楊

7、氏模量和最大伸長率進(jìn)行測試分析，靜態(tài)水接觸角對不用薄膜的親疏水性進(jìn)行分析比較。
　　結(jié)果:干燥狀態(tài)下，在555nm波長處交聯(lián)膜和殼聚糖表面改性膜的可見光透過率分別為70％和75％，而羊膜僅為40％;在濕潤狀態(tài)下，在555nm波長處交聯(lián)膜和殼聚糖表面改性膜的可見光透過率分別增加到88％和89％，羊膜在該處的可見光透過率增加到74％。膠原-透明質(zhì)酸復(fù)合電紡膜、交聯(lián)膜和殼聚糖改性膜的紅外光譜圖中均存在膠原、透明質(zhì)酸特征性吸收峰，但交聯(lián)膜

8、和殼聚糖改性膜在2000-1000 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度降低，位于3314 cm-1、1619 cm-1和1430 cm-1附近的吸收峰信號變?nèi)?殼聚糖改性膜中酰胺A，酰胺Ⅰ，Ⅱ鍵吸收峰波幅較交聯(lián)膜增強(qiáng);在交聯(lián)膜和殼聚糖改性膜中，均未檢測到聚環(huán)氧乙烷特征性吸收峰;在殼聚糖改性膜中檢測到所有殼聚糖特征性吸收峰;殼聚糖改性膜與去上皮人羊膜相比均具有膠原、透明質(zhì)酸特征性吸收峰，但殼聚糖改性膜在1750-1000 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰波幅

9、較去上皮人羊膜者低。殼聚糖改性膜的平均抗拉強(qiáng)度為31.39±6.61Mpa，略低于去上皮人羊膜（39.72±4.43 Mpa），而在同等強(qiáng)度外力作用時，形變量為交聯(lián)膜＞殼聚糖改性膜＞去上皮人羊膜。交聯(lián)膜和殼聚糖改性膜的平均水接觸角分別為18.6±1.7°和23.9±2.6°，均小于去上皮人羊膜（63.4±3.3°）。
　　結(jié)論:膠原-透明質(zhì)酸交聯(lián)膜和殼聚糖改性膜具有優(yōu)于去上皮人羊膜組織的良好透明性;經(jīng)電紡、交聯(lián)和殼聚糖表面改性三步

10、法處理后膠原和透明質(zhì)酸仍保持原有活性不變;殼聚糖改性膜具有與去上皮人羊膜相似的化學(xué)組成;雖然復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度稍遜于去上皮人羊膜組織，但其更好的彈性和更高的親水性對于我們后續(xù)細(xì)胞和組織相容性研究奠定了有利的理論基礎(chǔ)。
　　第三部分仿去上皮羊膜微納結(jié)構(gòu)殼聚糖改性膠原-透明質(zhì)酸復(fù)合電紡膜生物相容性研究。
　　目的:分析評價殼聚糖改性膠原-透明質(zhì)酸復(fù)合電紡膜的生物相容性，為仿羊膜微納結(jié)構(gòu)眼表覆膜的臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)和實(shí)驗基

11、礎(chǔ)，從根本上推進(jìn)眼表修復(fù)用仿生人工薄膜材料的研制。
　　方法:以去上皮人羊膜為對照，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法將人角膜上皮、結(jié)膜上皮細(xì)胞接種于殼聚糖改性膜上，掃描電鏡觀察細(xì)胞的粘附形態(tài)，活死細(xì)胞染色檢測薄膜對細(xì)胞的毒性作用， CCK-8法比較細(xì)胞在薄膜表面的增殖能力;構(gòu)建大鼠角膜急性堿燒傷模型，熒光素鈉和蘇木精-伊紅染色觀察殼聚糖改性膜移植后角膜上皮再生水平，肉眼觀察基質(zhì)水腫和炎癥反應(yīng)情況，評價薄膜的可操作性和在體生物相容性。
　　

12、結(jié)果:角膜上皮細(xì)胞在殼聚糖改性膜上具有類似于正常角膜上皮的無規(guī)則扁平樣外觀，結(jié)膜上皮細(xì)胞在該膜上表現(xiàn)出細(xì)胞與材料相互融合現(xiàn)象;接種24h后在殼聚糖改性膜上角膜上皮細(xì)胞可檢測到極少量的細(xì)胞死亡而結(jié)膜上皮細(xì)胞未檢測到細(xì)胞死亡;細(xì)胞的增殖能力隨培養(yǎng)時間的延長而增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，而同種細(xì)胞在不同薄膜上的增殖能力無明顯差異(p=1.12);殼聚糖改性膜在大鼠急性堿燒傷角膜表面保持良好的透明性，與基質(zhì)面貼合緊密;薄膜下可見角膜