利多卡因預(yù)處理對(duì)高糖孵育H9c2大鼠成肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的影響.pdf

1、研究背景：
　　 在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷加重,甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury)。現(xiàn)已證實(shí),心、腦、肝、腎、肺、胃腸道、肢體及皮膚等多種組織器官都存在缺血再灌注損傷的現(xiàn)象。心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/repeifusion injury,MIRI)為再灌注后缺血的心肌出現(xiàn)舒縮功能降低、心律失常、心肌能量代謝障礙、超微結(jié)構(gòu)的

2、變化和血管無復(fù)流等現(xiàn)象。缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制尚未徹底闡明,既往研究證實(shí)氧自由基(oxygen free radical,OFR)的作用、白細(xì)胞激活、內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell,EC)功能障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣超載以及細(xì)胞凋亡是引起缺血一再灌注損傷的重要原因。
　　 糖尿病(diabetes mellitus,DM)是常見病、多發(fā)病,現(xiàn)已明確DM是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病發(fā)病的一個(gè)重要因素。流行病學(xué)資料顯示:DM人群中

3、心絞痛、急性心肌梗死(acrue myocardial inarction,AMI)、充血性心力衰竭以及嚴(yán)重心律失常等疾病發(fā)病率遠(yuǎn)高于非DM患者,而且當(dāng)DM患者并發(fā)心肌梗死后行藥物或手術(shù)(包括冠狀動(dòng)脈搭橋和導(dǎo)管介入)治療,效果均不及非DM患者。人們將這種不良后果歸咎于缺血再灌注(ischemia/repeifusion,I/R),這可能與糖尿病患者冠狀動(dòng)脈粥樣病變嚴(yán)重而彌漫、內(nèi)皮功能障礙、儲(chǔ)備能力降低所造成的心肌灌注不良有關(guān),另外DM本

4、身的促凝和炎癥狀態(tài),易形成冠狀動(dòng)脈內(nèi)微血栓堵塞；DM心肌缺氧應(yīng)激,NO活性降低,存在冠脈微循環(huán)痙攣。而日本的一項(xiàng)多中心研究卻顯示:急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(pereultaneous coronaryintervention,PCI)住院期間患者病死率與是否患有DM無關(guān),而與血糖增高有關(guān),且發(fā)現(xiàn)無DM但伴有高血糖者的死亡率最高,該研究推測(cè)這可能與DM性冠心病梗死相關(guān)血管(infarct-related artery,IRA)再通后I/R

5、損傷增加有關(guān)。
　　 基礎(chǔ)研究顯示DM發(fā)生時(shí),心肌組織的結(jié)構(gòu)、功能以及代謝均發(fā)生異常,主要表現(xiàn)為:①心肌能量代謝異常,且高糖環(huán)境能夠直接引起正常心肌細(xì)胞功能改變；②細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)控異常；③微血管病變和微循環(huán)障礙,緩激肽釋放酶一緩激肽系統(tǒng)在高血糖狀態(tài)下該系統(tǒng)被抑制；④高血糖時(shí)氧化應(yīng)激增加,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改變,激活細(xì)胞凋亡。國內(nèi)外研究證實(shí),DM急性期,NO代償性合成增加,I/R對(duì)DM心肌有保護(hù)作用；而DM晚期,由于慢性期NO減少,心肌肥厚

6、,收縮和舒張功能受損,心臟血管周圍或間質(zhì)纖維化,I/R后損傷后將加重心肌損害。
　　 近來,心肌缺血再灌注損傷和心肌保護(hù)一直是基礎(chǔ)研究和臨床研究的重點(diǎn)。1986年Murry等首次提出缺血預(yù)處理(Ischemia preconditioning,IPC)可以減輕缺血再灌注所致的心肌損傷,隨后的一系列研究則發(fā)現(xiàn)許多麻醉藥物(包括全身麻醉藥、阿片類鎮(zhèn)痛藥以及局部麻醉藥)預(yù)處理能產(chǎn)生與經(jīng)典缺血預(yù)處理同樣的心肌保護(hù)作用,這為預(yù)處理心肌保護(hù)

7、的臨床應(yīng)用開辟了新的途徑。利多卡因在急性心梗、惡性心律失常等引起的IR損傷治療中具有較好的效果。有關(guān)預(yù)防性應(yīng)用利多卡因的臨床有效性和安全性一直備受爭(zhēng)議。既往的薈萃分析(meta-analysis)表明預(yù)防性應(yīng)用利多卡因雖然可減少急性心肌梗死患者心室纖顫的發(fā)生,但卻增加了患者的死亡率。然而,一項(xiàng)多國家多中心觀察研究表明:預(yù)防性應(yīng)用利多卡因并不增加急性心肌梗死患者的死亡率,預(yù)防性應(yīng)用利多卡因也許是無害的?？偠灾?關(guān)于利多卡因預(yù)處理在心肌缺

8、血再灌注損傷防治中的作用目前尚不明了,更不能確定利多卡因預(yù)處理心肌保護(hù)效應(yīng)的具體作用機(jī)制。
　　 目的：
　　 本研究通過在體外細(xì)胞水平以缺氧復(fù)氧處理H9c2大鼠成肌細(xì)胞建立心肌缺血再灌注損傷模型,初步探討:①不同梯度濃度利多卡因預(yù)處理對(duì)缺氧復(fù)氧引起的心肌細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用；②利多卡因預(yù)處理對(duì)缺氧復(fù)氧引起的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制。③利多卡因預(yù)處理對(duì)高糖孵育下H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷是否具有保護(hù)作

9、用及與高糖孵育的關(guān)系。
　　 方法
　　 第一部分:研究不同濃度利多卡因預(yù)處理對(duì)H9c2大鼠成肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的影響。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為7組:正常對(duì)照組(NC組)、缺氧復(fù)氧損傷對(duì)照組(腿組)；利多卡因預(yù)處理組(LP組),根據(jù)利多卡因的不同濃度對(duì)分為L(zhǎng)P1(1μmol/L)、LP2(2.51μmol/L)、LP3(5μmol/L)、LP4(10μmol/L)、LP5(20μmol/L)組,每組6孔。心肌細(xì)胞損傷程度以心肌細(xì)胞活

10、力和乳酸脫氫酶(LDH)活性來表示,同時(shí)檢測(cè)心肌細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。
　　 第二部分:研究利多卡因預(yù)處理對(duì)H9c2大鼠成肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷后caspase-3活性、鈣超載的影響。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為3組:①正常對(duì)照組(NC組)；②缺氧復(fù)氧組(H/R組)；③利多卡因預(yù)處理組(LPC組)。心肌細(xì)胞損傷程度以心肌細(xì)胞活力和乳酸脫氫酶(LDH)活性來表示。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。通過免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢

11、測(cè)心肌細(xì)胞胞漿caspase-3的表達(dá)。熒光分光光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。
　　 第三部分:研究利多卡因預(yù)處理對(duì)高糖孵育下H9c2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧性損傷是否具有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為二組,即正常糖濃度組(N組)和高糖濃度組(H組),每組又分為正常對(duì)照組(NC組和HC組)、缺氧復(fù)氧損傷組(NHR組和HHR組)和利多卡因預(yù)處理組(NLP組和HLP組)。心肌細(xì)胞損傷程度以H9c2細(xì)胞活力和培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)釋放量來表示,同

12、時(shí)檢測(cè)H9c2細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。
　　 結(jié)果
　　 第一部分:與NC組比較,HR組細(xì)胞活力顯著減弱,LDH釋放量顯著增加,并且MDA含量增多,SOD活性降低；與HR組比較,L2～5組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng),LDH釋放量顯著降低；并且MDA含量下降,SOD活性增強(qiáng)；且Pearson積差相關(guān)分析顯示,細(xì)胞活力強(qiáng)弱的變化與LDH釋放量(r=-0.870,P=0.000)、MDA含量(r=-0.9

13、24,P=0.000)呈負(fù)相關(guān),與SOD活性呈正相關(guān)(r=0.894,P=0.000)。細(xì)胞活力的增強(qiáng)與利多卡因濃度的增加呈正相關(guān)(r=0.976,P=0.001),與LDH釋放量(r=-0.912,P=0.011)和MDA含量(r=-0.969,P=0.001)呈負(fù)相關(guān)。
　　 第二部分:與NC組比較,缺氧復(fù)氧處理細(xì)胞后可使其LDH釋放量顯著增高(P<0.01),細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01),流式細(xì)胞儀檢測(cè)到大量心肌細(xì)胞凋

14、亡,凋亡率為20.12±1:2.19％。利多卡因預(yù)處理細(xì)胞可顯著提高心肌細(xì)胞活力(P<0.01),降低LDH釋放量和細(xì)胞凋亡率(P<0.01)。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,缺氧復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞中caspase-3活性增強(qiáng)；而利多卡因預(yù)處理則可降低caspase-3活性。熒光風(fēng)光度法檢測(cè)顯示,缺氧復(fù)氧損傷后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著升高；而利多卡因預(yù)處理則可降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。
　　 第三部分:①N組:缺氧復(fù)氧后細(xì)胞LDH釋放量、

15、MDA含量較NC組顯著增多,細(xì)胞活力、SOD活性顯著減弱。缺氧前利多卡因預(yù)處理細(xì)胞后,其細(xì)胞MDA含量較NHR組顯著減少,SOD活性顯著增強(qiáng)(P均<0.01)；②H組:缺氧復(fù)氧后,與HC組比較,其LDH釋放量、MDA含量顯著增多,而細(xì)胞活力、SOD活性顯著降低；而利多卡因預(yù)處理細(xì)胞后,與HHR組比較,其LDH釋放量、MDA含量顯著減少,細(xì)胞活力、SOD活性顯著增高(P均<0.01)。③與N組比較:高糖孵育心肌細(xì)胞后其LDH釋放量、MDA

16、含量較NC組顯著增多,而細(xì)胞活力、SOD活性則顯著降低(P均<0.01)。④高糖與實(shí)驗(yàn)處理(分組)兩因素的交互效應(yīng)均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。
　　 結(jié)論
　　 (1)本研究濃度范圍內(nèi)的利多卡因能減輕心肌細(xì)胞的缺氧復(fù)氧損傷,并呈濃度依賴性:其機(jī)制可能與利多卡因的抗自由基作用、離子通道阻滯功能以及抗凋亡作用有關(guān)。
　　 (2)缺氧前給予濃度為10μmol/L的利多卡因能夠增強(qiáng)H9c2心肌細(xì)胞耐受缺氧復(fù)氧