Obestatin和胰島素之間的相互抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:隨著人類生活水平和生存環(huán)境的改變，內(nèi)分泌與代謝疾病的發(fā)病率逐年上升。超重、肥胖和糖尿病是其中最常見的疾病，對(duì)人類健康有極大危害。攝食行為和代謝調(diào)節(jié)是機(jī)體維持能量平衡的重要機(jī)制，當(dāng)攝入遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于消耗時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)能量平衡失調(diào)，引起脂肪堆積，導(dǎo)致超重、肥胖以及與肥胖相關(guān)聯(lián)的各種并發(fā)癥如糖尿病。深入研究機(jī)體攝食行為和代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制無疑會(huì)為肥胖和糖尿病的防治提供新的思路。
　　 生長(zhǎng)激素釋放肽(ghrelin)是1999年Ko

2、jima在尋找生長(zhǎng)激素促分泌物受體(GHS-R)的內(nèi)源性配體時(shí)發(fā)現(xiàn)的。近年來研究發(fā)現(xiàn)其是一個(gè)重要的食欲和體重調(diào)節(jié)激素，可通過促進(jìn)食欲，增加攝食量，以及影響物質(zhì)和能量代謝的各個(gè)方面，導(dǎo)致體重增加、脂肪積累和肥胖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦顯示直接給予外源性ghrelin可以明顯增加大鼠或小鼠的攝食量并導(dǎo)致肥胖。
　　 肥胖抑制素(obestatin)是Zhang等在大鼠身上發(fā)現(xiàn)的含23個(gè)氨基酸的多肽，它由ghrelin前體原產(chǎn)生，ghrelin基

3、因編碼產(chǎn)物經(jīng)翻譯后剪切和修飾，其乙?；a(chǎn)物為ghrelin，其C末端酰胺化產(chǎn)物為obestatin。外源性ghrelin可增加食物的攝入及體重，降低能量消耗，而外源性obestatin則明顯抑制其攝食量及體重的增加，且相同劑量的obestatin可以完全拮抗ghrelin促進(jìn)小鼠攝食和增加體重的作用；以上各種研究提示來源相同的obestatin和ghrelin可能是調(diào)控機(jī)體食欲和體重的一對(duì)功能完全相反的調(diào)節(jié)因子。
　　 胰島素是

4、體內(nèi)降低血糖，同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素，與肥胖和糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Ghrelin可以升高血糖水平，而對(duì)胰島素分泌的調(diào)節(jié)具有葡萄糖濃度依賴性，抑制低濃度葡萄糖刺激的胰島素分泌，而促進(jìn)高濃度葡萄糖刺激的胰島素分泌。Obestatin對(duì)胰島素分泌的影響是obestatin研究領(lǐng)域的新進(jìn)展，我們課題組觀察到obestatin能夠抑制葡萄糖刺激引起的胰島素分泌。
　　 目前關(guān)于obestatin和胰島素之間的關(guān)系還沒有

5、太多研究。因此，本課題擬從以下幾個(gè)方面探討obestatin和胰島素的相互作用：
　　 1、葡萄糖和胰島素對(duì)obestatin分泌的影響。
　　 2、Obestatin、ghrelin血漿濃度和其基因表達(dá)在1型糖尿病大鼠中的變化。
　　 3、Obestatin對(duì)INS-1細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)和高糖刺激狀態(tài)下胰島素分泌的影響，并研究其信號(hào)通路機(jī)制。
　　 4、Obestatin對(duì)INS-1細(xì)胞通道電流的影響。

6、r>　　 第一部分葡萄糖和胰島素對(duì)大鼠血漿obestatin的影響
　　 目的:探討葡萄糖和胰島素對(duì)obestatin血漿濃度的影響。
　　 方法:SD大鼠禁食4小時(shí)，分為3組：A，對(duì)照組，灌輸生理鹽水；B，高血糖鉗制組，20％的葡萄糖溶液灌輸，調(diào)節(jié)速度使血糖濃度維持在16.7 mM附近；C，高胰島素-正常血糖鉗制組，按每千克體重7.5 mU/min的速度灌輸胰島素，同時(shí)灌注20％葡萄糖溶液，調(diào)節(jié)灌輸速度使大鼠血糖維持

7、在對(duì)照組水平。實(shí)驗(yàn)開始后每15分鐘收集5μl血樣測(cè)血糖；并且每60分鐘收集150μl血樣，用ELISA法檢測(cè)血漿obestatin和胰島素。
　　 結(jié)果:對(duì)照組的血漿obestatin濃度在實(shí)驗(yàn)過程中緩慢下降，但高血糖鉗制組和高胰島素-正常血糖鉗制組血漿obestatin濃度下降更為明顯。120分鐘時(shí)，對(duì)照組血漿obestatin濃度為1.188±0.242μg/L，高血糖鉗制組和和高胰島素-正常血糖鉗制組分別為0.860±0.

8、180μg/L和0.829±0.203μg/L，均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05，n=6)，兩個(gè)處理組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。180分鐘時(shí)，對(duì)照組血漿obestatin濃度為1.049±0.269μg/L，高血糖鉗制組和高胰島素-正常血糖鉗制組的血漿obestatin濃度分別為0.398±0.149μg/L和0.369±0.132μg/L，均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01，n=6)，兩個(gè)處理組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

9、r>　　 結(jié)論:高濃度胰島素抑制血漿obestatin濃度，而高濃度的血糖對(duì)血漿obestatin濃度可能沒有影響。
　　 第二部分1型糖尿病大鼠血漿ghreIin、obestatin濃度及其基因表達(dá)的變化
　　 目的:觀察1型糖尿病大鼠血漿ghrelin、obestatin濃度及其基因表達(dá)的變化。
　　 方法:采用腹腔注射鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)的方法建立大鼠1型糖尿病模型。每周測(cè)定大

10、鼠血糖、體重，每2周收集血樣，ELISA法測(cè)血漿ghrelin、obestatin濃度，取胃組織，定量PCR檢測(cè)ghrelin/obestatin mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果:(1)糖尿病大鼠血漿obestatin濃度在造模后2-6周與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，8周和10周則高于對(duì)照組(p＜0.05，n=5)；(2)糖尿病大鼠血漿ghrelin濃度在造模后2周與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4周開始高于對(duì)照組(p＜0.05，n=5)；(

11、3)糖尿病大鼠血漿ghrelin/obestatin比值呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)；(4)10周后胃組織ghrelin/obestatinmRNA表達(dá)下降(p＜0.01，n=5)；(5)10周時(shí)糖尿病組大鼠體重變化與ghrelin水平和ghrelin/obestatin比值均呈負(fù)相關(guān)(p＜0.05，n=5)。
　　 結(jié)論:1型糖尿病大鼠血漿ghrelin、obestatin濃度升高，胃組織ghrelin/obestatin mRNA表達(dá)

12、下降。
　　 第三部分 Obestatin對(duì)高糖刺激胰島素分泌的影響及其機(jī)制研究
　　 目的:觀察obestatin對(duì)高糖刺激引起胰島素分泌的作用及其機(jī)制。
　　 方法:以培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞為模型，觀察胰島素基礎(chǔ)分泌、高糖刺激胰島素分泌、obestatin對(duì)高糖刺激胰島素分泌的抑制作用，以及各種信號(hào)通路阻斷劑對(duì)obestatin作用的影響。
　　 結(jié)果:(1)高濃度的葡萄糖能夠刺激INS-1細(xì)胞分泌胰島

13、素；(2)10 nM和100 nM的obestatin能夠抑制INS-1細(xì)胞高糖刺激胰島素分泌(p＜0.01，n=6)和INS-1細(xì)胞的基礎(chǔ)激胰島素分泌(p＜0.05，n=6)；(3)PTX和chelerythrine(PKC抑制劑)能夠抑制obestatin的作用(p＜0.01，n=6)。Xestospongin C(IP3受體阻斷劑)，U73122(PLC抑制劑)和neomycin(PLC/PLD抑制劑)對(duì)obestatin的作用沒

14、有明顯影響。
　　 結(jié)論:Obestatin對(duì)INS-1細(xì)胞葡萄糖刺激胰島素分泌的抑制作用的部分機(jī)制可能是通過PTX敏感G蛋白和細(xì)胞膜PKC介導(dǎo)的。
　　 第四部分 Obestatin對(duì)INS-1細(xì)胞通道電流的影響
　　 目的:觀察Obestatin對(duì)INS-1細(xì)胞通道電流的影響。
　　 方法:以培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞為模型，利用穿孔全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究obestatin對(duì)細(xì)胞膜電位、動(dòng)作電位、ATP敏感鉀

15、電流(ATP-sensitive potassium currents，IKATP)和電壓敏感鈣電流(Voltage-dependent calcium currents，Icav)的影響。
　　 結(jié)果:(1)Obestatin對(duì)靜息膜電位無明顯作用，但能夠降低葡萄糖刺激引起的動(dòng)作電位的幅度，10 nM和100 nM obestatin作用5 min后，INS-1細(xì)胞動(dòng)作電位幅度分別為給予obestatin之前的69.4±9.6

16、％和39.8±7.0％，與對(duì)照(93.1±3.6％)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01，n=5)；(2)Obestatin對(duì)IKATP無明顯作用，但能夠劑量依賴性地抑制Icav，10 nM和100 nM obestatin作用5 min后，Cav通道電流分別為給藥前的60±9％和45±6％，與對(duì)照組(97±8％)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01，n=5)。
　　 結(jié)論:Obestatin抑制細(xì)胞膜Cav通道電流。結(jié)合第三部