利用RNA干擾技術(shù)研究PARP1在氫醌細胞毒性及DNA甲基化過程中的作用.pdf

1、研究目的：本研究通過構(gòu)建PARP1基因的發(fā)卡樣siRNA(smallinterfereRNA)真核表達載體，利用siRNA載體來抑制PARP1基因的表達，從而探索PARP1蛋白在氫醌細胞毒作用以及DNA甲基化過程中的作用，為進一步研究PARP1的功能奠定基礎。 1、材料與方法 1.1材料 1.1.1細胞人支氣管上皮細胞(HBE)由廣州醫(yī)學院饋贈，細胞以DMEM/10％FCS，37℃，5％CO2培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)傳代。

2、 1.1.2菌株大腸桿菌DH5α菌株由本教研室保存。 1.1.3質(zhì)粒載體RNAi-ReadypSIREN-RetroVector購于美國Clontech公司，全長6.4kb，是一帶有BamHI和EcoRI兩酶切位點的線性載體；pEGFP-C1綠色熒光蛋白載體購于美國Clontech公司，全長4.7kb。 1.2方法 1.2.1發(fā)卡樣PARP1基因siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建根據(jù)GenBank提供的PARP

3、1基因cDNA序列，通過BD公司提供的軟件以及BLAST挑選長為19個堿基的特異性寡核苷酸序列(5'-ATCTTCTCAAGGCAGACAC-3')，合成其發(fā)卡樣兩端配對siRNA寡核苷酸鏈，同時合成互補鏈，分別在5'和3'端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。將上下鏈經(jīng)過變性、復性后形成雙鏈PARP1siRNA。采用DNA重組技術(shù)，將PARP1siRNA雙鏈定向克隆入U6啟動子指導的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體RNAi-ReadypSIREN-

4、RetroQVector。轉(zhuǎn)化連接子，37℃培養(yǎng)過夜，長出的單個單菌落為轉(zhuǎn)化菌菌落。挑單菌落種于10mlLB(含60μg/ml氨芐青霉素)中，37℃搖菌過夜。收集細菌，按說明書操作小量快速抽提質(zhì)粒DNA，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。 1.2.2pEGFP-C1-PARP1siRNA真核表達載體構(gòu)建選擇酶切位點，將包括U6啟動子和siRNA序列的片段切下，并亞克隆至入CMV啟動子指導的pEGFP-C1熒光蛋白表達載體。轉(zhuǎn)化連接子

5、，37℃培養(yǎng)過夜，長出的單個單菌落為轉(zhuǎn)化菌菌落。挑單菌落種于10mlLB(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃搖菌過夜。收集細菌，按說明書操作小量快速抽提質(zhì)粒DNA，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。 1.2.3PARP1蛋白缺陷細胞建立HBE細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，穩(wěn)定傳代后用于本實驗。90％融合的HBE細胞，分別轉(zhuǎn)染5μgpEGFP-C1-NegsiRNA、pEGFP-C1-PARPlsiRNA(LIPO

6、FECTIN法)，同時設未轉(zhuǎn)染對照。細胞轉(zhuǎn)染48h，換含800μg/lG418、10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，篩選10-14天，收集細胞，加細胞裂解液PMSF，提取細胞全蛋白。取50μg細胞全蛋白，10％SDS2PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，1∶500鼠抗人PARP1單抗，Westernblotting檢測胞內(nèi)PARP1的蛋白水平。 1.2.4PARP1蛋白缺陷細胞生物學性狀研究通過觀察轉(zhuǎn)染細胞生長形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、生長特性及細胞

7、周期等生物學特性，了解轉(zhuǎn)染細胞惡性程度情況。 1.2.5PARP1蛋白缺陷細胞對毒物作用的影響以PARP1蛋白缺陷細胞株為模型，用標準斷裂劑氫醌(hydroquinone,HQ)染毒，從微核形成率及細胞周期等方面測定細胞遺傳毒性，以研究PARP1蛋白功能及其缺陷細胞對HQ細胞毒作用的影響。 1.2.6PARP1蛋白缺陷細胞對DNA甲基化的影響HQ作用PARP1蛋白缺陷細胞后，用甲基化特異性PCR檢測其中p16RASSF1

8、A基因啟動子區(qū)甲基化情況，從RNA及蛋白水平檢測p16RASSF1A的表達。2、結(jié)果2.1發(fā)卡樣PARP1基因siRNA設計逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建根據(jù)GenBank提供的PARP1基因cDNA序列，合成兩對發(fā)卡樣siRNA寡核苷酸鏈，命名為P1，P2。通過分子克隆和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，成功構(gòu)建了發(fā)卡樣PARP1基因siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。同時構(gòu)建陰性siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。 2.2pEGFP-C1-P1siRNA和pEGFP-C

9、1-P2siRNA真核表達載體的構(gòu)建經(jīng)過亞克隆和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，成功獲得pEGFP-C1-P1siRNA和pEGFP-C1-P2-siRNA真核表達載體。同時構(gòu)建陰性siRNA熒光蛋白真核表達載體pEGFP-C1-NsiRNA。 2.3PARP1蛋白缺陷細胞建立對于三種質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HBE細胞48h后，在熒光顯微鏡下觀察到細胞綠色熒光蛋白表達，正式轉(zhuǎn)染成功，分別命名為HBEP1，HBEP2和HBEN，G418篩選后，提取

10、細胞全蛋白，Westernblotting鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者的PARP1蛋白表達分別為92.4％，17.8％和95.2％。說明pEGFP-C1-P2-siRNA載體能夠明顯抑制HBE細胞的PARP1表達。所以在后續(xù)實驗中使用該載體進行研究，將相應轉(zhuǎn)染的細胞命名HBEP細胞。 2.4PARP1蛋白缺陷細胞生物學性狀研究 2.4.1細胞生長形態(tài)觀察轉(zhuǎn)染初期HBEN、HBEP細胞形態(tài)變化明顯，失去類圓形生長，細胞內(nèi)顆粒明顯增多

11、，細胞形態(tài)成不規(guī)則型，但隨著傳代培養(yǎng)時間的增加，3種細胞形態(tài)趨于一致。 2.4.2細胞超微結(jié)構(gòu)變化HBE細胞核膜清晰完整，核仁明顯，線粒體膜完整，嵴明顯；HBEN、HBEP細胞形狀不規(guī)則，細胞核縮小、變形，胞漿出現(xiàn)空泡，基質(zhì)不明顯，嵴消失。 2.4.3細胞生長曲線3種細胞生長曲線均呈“S”形；三者生長速度接近。表明PARP1蛋白缺陷對細胞增殖能力無明顯影響。 2.4.4細胞周期觀察三種細胞在G1、G2和S期的分布

12、無顯著性差異(P＞0.05)，提示載體對細胞周期影響不大。 2.5PARP1蛋白缺陷細胞對毒物作用的影響 2.5.1細胞存活率用MTT法測定細胞生長抑制率分析，HQ對HBE和HBEP細胞的生長抑制作用在0～80μmol/L范圍內(nèi)與劑量正相關(guān)。 2.5.2HBE和HBEP細胞微核結(jié)果HBE、HBEN和HBEP細胞經(jīng)、HQ染毒后，各劑量組不同程度出現(xiàn)含微核的細胞，含微核的細胞中有一個或數(shù)個微核，與各自對照組比較，從2

13、0μmol/L的HQ劑量組開始HBE和HBEP細胞的微核率明顯增加(P＜0.05)。相關(guān)分析結(jié)果表明，兩種細胞的微核率與HQ劑量間存在量效關(guān)系。 2.5.3HBE和HBEP細胞染毒后細胞周期結(jié)果隨氫醌劑量增加，兩組細胞均出現(xiàn)G2期阻滯，以HBEP更為明顯。同時，對于HBEP還表現(xiàn)S期阻滯，但HBE細胞沒有S期阻滯。 2.5.4HBE和HBEP細胞的彗星實驗結(jié)果各劑量HQ處理后，兩種細胞的彗星實驗存在差別。其中HBE細胞表

14、現(xiàn)出DNA損害率與HQ劑量正相關(guān)。HBEP細胞在20-100μMHQ處理后，DNA損害率大于HBE，但當HQ劑量增加到160μM時，HBE的DNA損害程度比HBEP細胞嚴重。 2.6PARP1缺陷與DNA甲基化關(guān)系 2.6.1DNMT1的mRNA及蛋白表達：在HQ處理后的HBEP細胞中，DNMT1的表達增加，其RNA水平在染毒后第三天開始見到明顯上升(2.5)，第5天達到高峰(5.8)。相應DNMT1的蛋白表達水平也增加

15、。而在HQ處理HBE細胞則DNMT1表達無明顯變化。 2.6.2p16和RASSF1A基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)檢測經(jīng)過HQ處理和未經(jīng)HQ處理的HBEP細胞，其p16和RASSF1A基因啟動子區(qū)域的MSP檢測，都出現(xiàn)具有甲基化與未甲基化兩種條帶，而HBE細胞無論HQ處理與否，均只有未甲基化條帶。 2.6.3p16和RASSF1A的mRNA表達檢測對HBEP細胞進行p16和RASSF1ART-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)相應mRNA表達

16、降低，而在在5-Aza-CdR處理后，則上調(diào)。 3、結(jié)論：成功利用RNA干擾技術(shù)抑制PARP1基因表達，為研究PARP1基因的功能打下基礎。 在正常生長環(huán)境下，PARP1蛋白缺陷對細胞生長形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、生長速度以及細胞周期有輕微的影響。 PARP1參與了細胞HQ所致毒性的應答。且具有雙相性，既在中低劑量HQ作用下，PARP1的作用促進細胞修復，在高劑量HQ作用下，由于PARP1過度激活，促進細胞死亡。