胃腫瘤特異性-相關(guān)性抗原(TSA-TAA)的篩選和治療性抗體的研發(fā).pdf

1、目的：制備胃癌特異性功能性單克隆抗體，鑒定其相應(yīng)靶抗原蛋白，研究該單克隆抗體在體外和體內(nèi)的抑瘤功能，為胃癌的靶向治療提供候選抗體藥物。
　　方法：用源于4種胃癌細(xì)胞株（MKN45、SGC7901、NGC823及MKN28）的混合活性腫瘤細(xì)胞免疫BALB/C小鼠，并選擇高免疫反應(yīng)的小鼠脾臟與小鼠的SP2/0細(xì)胞系融合而產(chǎn)生的抗體雜交瘤。繼而通過(guò)對(duì)雜交瘤抗體抗胃癌細(xì)胞系的高通量篩選、對(duì)正常人的外周血單核白細(xì)胞（PBMC）對(duì)照篩選、對(duì)胃

2、癌患者腫瘤組織和癌旁正常組織對(duì)照篩選以及胃癌相關(guān)蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)（ELISA）檢測(cè)。綜合上述研究結(jié)果，選出命名為 MS57-2.1的胃癌特異性單克隆抗體進(jìn)行后續(xù)研究。接著利用免疫熒光技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鑒定 MS57-2.1單克隆抗體在胃癌細(xì)胞的定位。再通過(guò)免疫沉淀技術(shù)聯(lián)合高效液相色譜-電噴霧-離子阱質(zhì)譜（LC-ESI MS/M S）分析技術(shù)（亦即：親和純化-質(zhì)譜分析技術(shù)）鑒定MS57-2.1單克隆抗體的靶抗原蛋白質(zhì)。并以實(shí)

3、時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡技術(shù)（Western blotting）鑒定MS57-2.1單克隆抗體靶抗原在8株胃癌細(xì)胞株和1株胃粘膜永生化上皮細(xì)胞株mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)細(xì)胞增殖（CCK-8）實(shí)驗(yàn)、Transwell腫瘤遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)研究MS57-2.1單克隆抗體在體外抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等功能；并通過(guò)裸鼠腹腔種植胃癌細(xì)胞，以MS57-2.1單克隆抗體進(jìn)行體內(nèi)治療性實(shí)驗(yàn)。
　　

4、結(jié)果：雜交瘤聯(lián)合高通量流式細(xì)胞技術(shù)（HTS-FACS）篩選獲得5株抗胃癌特異性單克隆抗體，其中一株命名為MS57-2.1。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MS57-2.1單克隆抗體可與特定胃癌細(xì)胞結(jié)合，而與正常人外周血細(xì)胞（PBMC）不結(jié)合。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 MS57-2.1單克隆抗體可與胃癌細(xì)胞膜蛋白結(jié)合，而與幽門(mén)螺旋桿菌蛋白和胃癌臨床常用分子標(biāo)志物（CA15-3純化蛋白、CEA蛋白、PG-1/2蛋白）不結(jié)合或很少結(jié)合。細(xì)胞免疫熒光染色和免疫

5、細(xì)胞化學(xué)染色表明 MS57-2.1單克隆抗體的靶抗原主要定位于胃癌細(xì)胞膜表面（有少部分靶抗原蛋白質(zhì)定位于胃癌細(xì)胞漿）。親和純化-質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定獲得MS57-2.1單克隆抗體的靶抗原蛋白為腸型堿性磷酸酶（ALPI）和胎盤(pán)樣堿性磷酸酶（ALPPL2）。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ALPI和ALPPL2在8株胃癌細(xì)胞株和1株胃粘膜永生化上皮細(xì)胞株中在mRNA水平有不同程度的表達(dá)；Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ALPI和ALPPL

6、2在8株胃癌細(xì)胞株和1株胃粘膜永生化上皮細(xì)胞株中在蛋白質(zhì)水平有不同程度的表達(dá)。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，以MS57-2.1單克隆抗體處理MKN45和BGC823胃癌細(xì)胞48小時(shí)后，較無(wú)關(guān)同型對(duì)照抗體處理組，胃癌細(xì)胞增殖受到明顯抑制，MS57-2.1單克隆抗體處理組48小時(shí)抑制率為20％，無(wú)關(guān)同型對(duì)照抗體處理組48小時(shí)抑制率為1%（p值＜0.05)；MS57-2.1單抗處理后胃癌細(xì)胞MKN45和BGC823移動(dòng)能力受到明顯抑制，穿過(guò)小室細(xì)胞數(shù)（

7、37±2，59±2）顯著低于無(wú)關(guān)同型單抗對(duì)照組（177±4，147±4）和空白對(duì)照組（183±4，179±4），（P＜0.05）；在Transwell小室侵襲（已鋪膠）實(shí)驗(yàn)中，MS57-2.1單抗處理后胃癌細(xì)胞MKN45和BGC823侵襲能力受到明顯抑制，穿膜的細(xì)胞數(shù)（11±2，12±2），顯著低于無(wú)關(guān)同型單抗對(duì)照組（189±4，151±4）和空白對(duì)照組（207±4，181±4）（P＜0.05）。在裸鼠腫瘤腹腔播散實(shí)驗(yàn)中，MS57-2.

8、1單抗處理組的小鼠腫瘤播散程度（MKN45和BGC823腹腔腫瘤結(jié)節(jié)平均數(shù)分別為1.5枚/只和1枚/只）顯著低于無(wú)關(guān)單抗處理組（MKN45和BGC823腹腔腫瘤結(jié)節(jié)平均數(shù)目分別為8.5枚/只和7枚/只）和空白對(duì)照組（MKN45和BGC823腹腔腫瘤結(jié)節(jié)平均數(shù)目9枚/只和6.5枚/只）（P＜0.05）。
　　結(jié)論：（1）MS57-2.1單克隆抗體具有胃癌特異性。（2）MS57-2.1單克隆抗體的靶抗原蛋白是腸型堿性磷酸酶（ALPI）